بهبود تشخیص الکتروشیمیایی هیبریداسیون dna در الکترودهای اصلاح شده بر پایه نانوذرات

چکیده بطور کلی این پروژه شامل دو بخش کاملا مجزا می باشد. در بخش اول که در فصل های سوم، چهارم و پنجم به تشریح آن پرداخته شده است شامل طراحی زیست حسگرهای متفاوت بر اساس نانوذرات گوناگون بوده است. در بخش دوم که در فصل ششم به تشریح آن پرداخته شده است طراحی حسگر و بررسی رفتار آن جهت اندازه گیری ترکیبات بیولوژیکی و محاسبه برخی از پارامترهای سینتیکی و ترمودینامیکی ترکیبات بیولوژیکی مختلف است. در فصل سوم از بخش اول این پروژه، ابتدا به روش الکتروشیمیایی، نانو ذره طلا را بر روی الکترود خمیر کربن ترسیب کرده پس از تثبیت dna تک رشته ای پروب تیول دار شده بر روی الکترود اصلاح شده با نانوذره طلا خصوصیت و رفتار سطح الکترود اصلاح شده و همچنین تشخیص هیبریداسیون از طریق ولتامتری چرخه ای، روش ولتامتری پالس تفاضلی و روش امپدانس بررسی گردید. نکته ی قابل توجه این که، با هیبرید شدن پروب با تک رشته مکمل علامت تجزیه ای متیلن بلو که به-عنوان شناساگر الکتروفعال به کار رفته است تغییر می کند در صورتی که هنگامی که هیبریداسیون با رشته غیر مکمل انجام می شود تغییری در علامت تجزیه ای دیده نمی شود. نتیجه فوق این امکان را فراهم می آورد تا بتوان تک رشته ای مکمل را از تک رشته ای غیر مکمل تشخیص داد. سپس با استفاده از این الکترود و با کمک آنزیم dna پلیمراز و نوکلئوتیدهای موجود سنتز dna در محلول و بدون کمک pcr انجام گردید. فصل اول این پروژه بیشتر جنبه کیفی داشته و در آن علاوه بر سنتز رشته dna به کمک آنزیم تمام شرایط لازم برای انجام فرایند هیبریداسیون از جمله دما و غلظت و همچنین روش هیبریداسیون و در نهایت زمان و غلظت متیلن بلو به عنوان شناساگر بهینه گردید. در فصل چهارم از بخش اول پس از ساخت نانو صفحه گرافن اکسید و کاهش شیمیایی آن، دو زیست حسگر الکتروشیمیایی با کاربرد گرافن و الکترود کربن شیشه ای توسعه یافته است. به منظور افزایش حساسیت این زیست حسگر ابتدا سطح الکترود با گرافن اصلاح شده و سپس فعال شد. در پایان دو dna کاوشگر (پروب) آمین دار شده با توالی های متفاوت بر روی دو الکترود مجزا قرار گرفت. تمام مراحل از جمله زمان تثبیت رشته کاوشگر، زمان هیبریداسیون با رشته مکمل و دمای لازم برای هیبرید شدن، همچنین زمان لازم برای قرار گرفتن tween برای حذف رشته های dnaای که به طو غیراختصاصی بر روی سطح الکترود قرار گرفته اند، بهینه شد. برای بهینه سازی و بررسی هیبریداسیون دو توالی dna با رشته مکمل خود، از روش ولتامتری چرخه ای و اسپکتروسکپی امپدانس الکتروشیمیایی استفاده شد. سرانجام محدوده خطی، حد تشخیص و تکرارپذیری روش برای اندازه گیری dna در سطح هر دو زیست حسگر طراحی شده گزارش شد. منحنی کالیبراسیون رسم شده برای این زیست حسگر دارای دو محدوده خطی ازm 20-10 × 0/1 تا m 14-10 × 0/1 و محدوده دوم ازm 14-10 × 0/1 تاm 10-10 × 0/1 بدست آمد. بر اساس منحنی کالیبراسیون حد تشخیص آمیلوژنین در سطح الکترود اصلاح شده با گرافن اکسید کاهش یافته و تک رشته پروبm 21-10 × 2/3 محاسبه شد. در فصل پنجم از بخش اول ابتدا نانولوله کربنی چند دیواره mwcnt)) به دو روش الکتروشیمیایی و شیمیایی عامل دار شد. پس از تثبیت آن بر روی الکترود کربن شیشه ای دو زیست حسگر الکتروشیمیایی بر اساس gce اصلاح شده باmwcnt عامل دار شده و دو dna آمین دار شده با توالی متفاوت ارائه شد. از mwcnt عامل دار شده برای افزایش حساسیت و تثبیت dna آمین دار شده بر روی الکترود استفاده شد. پس از بهینه سازی شرایط ساخت این دو زیست حسگر، هیبریداسیون رشته های مکمل با کمک روش های امپدانس الکتروشیمیایی و ولتامتری مورد بررسی قرار گرفت. زیست حسگرهای طراحی شده برای تشخیص هیبریداسیون dna با حد تشخیص های پایین و قابل مقایسه ای با سایر روش های معمول ارائه شده اند. برای روش شیمیایی محدوده خطی در نمودار کالیبراسیون ازm 17-10 × 0/1 تا m 12-10 × 0/1 و برای روش الکتروشیمیایی ازm 18-10 × 0/1 تاm 14-10 × 0/1 بدست آمد. همچنین حدتشخیص برای روش الکتروشیمیایی نیز پایین تر از روش شیمیایی بدست آمد. در بخش دوم یا به عبارتی فصل ششم این تحقیق، ابتدا رفتار الکتروشیمیایی الکترود اصلاح شده با نانولوله های کربنی چند دیواره ای و ترکیب آلی و جدید2و2 -]1و2-اتانیدیل بیس (نیتریلومتیلیدین)_ بیس هیدروکینون برای اندازه گیری اپی نفرین، بررسی شده است. پارامترهایی از اصلاح گر تثبیت شده بر روی سطح الکترود مانند ضریب انتقال و تعداد الکترون و پروتون مبادله شده در اثر اکسایش، از بررسی ولتاموگرام های چرخه ای به دست آمدند. سپس اکسایش الکتروکاتالیزوری اپی نفرین در سطح الکترود اصلاح شده با روش ولتامتری چرخه ای مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که اضافه ولتاژ اکسایش اپی نفرین به میزان mv222 کاهش می یابد و افزایش شدت جریان قابل ملاحظه ای نیز رخ می دهد. پارامترهای مختلفی همچون ph محلول بهینه شدند. همچنین از روی نمودار تافل و رابطه مورد نظر مقدار ? برای اپی نفرین 46/0 تعیین شد که در توافق خوبی با کارهای قبلی است. در با مطالعات کرونوآمپرومتری نیز ضریب نفوذ اپی نفرین d)) برابر cm2 s-16-10 × 67/4 محاسبه شد. اندازه-گیری اپی نفرین به روش ولتامتری پالس تفاضلی نشان می دهد که منحنی کالیبراسیون در گستره ی غلظتی mm 020/0 – 005/0 و mm 00/6 – 02/0 خطی است و حد تشخیص روش برابر µm0/1 می باشد. همچنین مشخص شد که با روش ولتامتری پالس تفاضلی، الکترود توانایی جداسازی دماغه های اکسایشی اپی نفرین و استامینوفن را دارد درحالی که در حالت عادی همپوشانی دارند. به منظور بررسی کارایی روش پیشنهادی، اندازه گیری در نمونه حقیقی دارویی ( آمپول) انجام گرفت و نتایج قابل قبولی را ارائه کرد. در قسمت دوم این بخش، الکترود خمیر کربن جدیدی همراه با نانو ذره کربنی و اصلاحگر 7-( 3و4دی هیدروکسی فنیل) 10و 10 دی متیل 9و 10و 11و 12 تترا هیدرو بنزو (c) اکریدین 9 (h 7) برای اندازه گیری ایزوپروترونول بهینه سازی شد. مقدار ضریب انتقال اصلاحگر (?) تعیین گردید و اکسایش ایزوپروترونول در سطح این الکترود با روش ولتامتری چرخه ای بررسی شد که کم شدن اضافه ولتاژ و افزایش شدت جریان اکسایش که از مشخصه-های الکتروکاتالیز هستند، مشاهده شد. مقدار متوسط ثابت انتقال بار ظاهری بین الکترود و اصلاح گر تثبیت شده بر روی سطح الکترود (ks) s-199/1 و مقدار پوشش سطحی برابر با mol.cm-210-10 × 27/3 برای الکترود محاسبه گردید. مطالعات ولتامتری پالس تفاضلی نیز نشان داد که منحنی کالیبراسیون اندزه گیری ایزوپروترونول در محدوده غلظت های µm25/0 تا µm0/20 و در محدودهµm 0/20 تا mm0/ 2خطی است. با استفاده از روش پالس ولتامتری تفاضلی دماغه های آندی اکسایش چهار گونه ایزوپروترونول، اوریک اسید، فولیک اسید و تریپتوفان در سطح این الکترو اصلاح شده به صورت چهار دماغه ولتامتری مجزا و قابل تشخیص در آمده که نشان می دهد امکان همزمان سنجش این چهار گونه در حضور هم توسط این الکترود اصلاح شده میسر است. نهایتاً کارایی روش پیشنهادی برای اندازه گیری ایزوپروترونول، در دو نمونه حقیقی با روش افزایش استاندارد انجام شد. در قسمت سوم از این بخش یک الکترود خمیر کربن اصلاح شده با گرافن اکسید کاهش یافته و نانو لوله های کربنی و کمپلکس کبالت (ii) (بیس بنزوئیل استون اتیلن دیمینو) تهیه شده و سپس از آن برای اندازه گیری همزمان ایزوپروترونول، کاپتوپیریل و تریپتوفان استفاده شد. الکترود تهیه شده فعالیت الکتروکاتالیستی بسیار موثری برای اکسیداسیون ایزوپروترونول در بافر فسفات m 1/0 با 0/7 ph= نشان داد. مطالعات ولتامتری موج مربعی نیز نشان داد که منحنی کالیبراسیون اندزه گیری ایزوپروترونول در محدوده غلظت های µm125/0 تا µm0/30 و در محدودهµm 0/30 تا µm0/300 خطی است و حد تشخیص روش برابرnm0/50 می باشد. در پایان مشاهده شد که روش پیشنهادی برای اندازه گیری ایزوپروترونول، در دو نمونه حقیقی آمپول و نمونه سرم خون انسان با روش افزایش استاندارد توانایی لازم را دارد.