مطالعه اثر تجمعی جهش های k189v و v267i بر فعالیت رنیلا لوسیفراز 8.6-545 rluc

پروب بیولومینسانس ابزار ارزشمند در مطالعات زیست شناسی اخیر و همچنین در حیطه تشخیص پزشکی می باشد. رنیلا لوسیفراز(rluc) طبیعی، آنزیمی بدون نیاز به کوفاکتور، تک زیر واحدی و پروتئین منتشر کننده ی نور در طیف آبی رنگ است. با توجه به عدم نیاز به هر گونه کوفاکتور، پروتئینrluc برای مطالعه وقایع بین و درون سلولی در طول تصویربرداری در داخل بدن مفید است. با این حال، جذب قوی نور آبی توسط بافت موجب محدودیت کاربرد آن می شود. اخیرا، rluc جدید با جابجایی نور قرمز با استفاده از تکامل هدفمند توسط گروه ما توسعه داده شد. در این مطالعه، این است بیان rluc جهش یافته جدید در میزبان باکتریایی مورد بررسی قرارگرفت و همچنین، تخلیص rluc با جابجایی نورقرمز انجام شد و پارامترهای کینتیک آنزیم از جمله km و vmax بررسی شده است. جهش جدید و کدون بهینه سازی شده rluc در وکتور بیانیpet-21b مونتاژ شد. ناقل نوترکیب به باکتری e.coli bl21 منتقل شد و القاء بیان پروتئین توسط اضافه کردن iptg در 25 درجه سانتیگراد انجام شد. تولید رنیلا لوسیفراز توسط تجزیه و تحلیل لیز سلول برروی ژل الکتروفورز پلی اکریلامید-سدیم دودسیل سولفات بررسی شد. علاوه بر این، تایید بیان با استفاده از فن آوری لومینومتریک در حضور کولنترازین مورد سنجش قرار گرفت. برای خالص سازی، لیز سلولی به دست آمده در ستون نیکل-سفاروز خالص شد. تعیین پارامترهای کینتیک توسط اندازه گیری اوج تابش نور با لومینومتر انجام شد، شروع واکنش با تزریق لوسیفراز رقیق شده به معرف سنجش شد. km و vmax آنزیم با اضافه کردن محلول سوبسترا شامل طیف وسیعی از غلظت کولنترازین مورد سنجش قرار گرفت. سرعت اولیه به عنوان واحد نور نسبی در هر ثانیه (rlu.s-1)، و ارزش km و vmax توسط نمودارمیکائیلیس-منتن به دست آمد.