طراحی آزمایش الایزا با استفاده از ترکیبی از آنتی ژن های نوترکیب tggra7 و tgsub1 جهت تشخیص توکسوپلاسموز در گاومیش رودخانه ای

توکسوپلاسما گوندای انگل تک یاخته داخل سلولی اجباری است که در تمام دنیا از نظر پزشکی و دامپزشکی اهمیت قابل توجهی دارد. تشخیص دقیق توکسوپلاسموز به عنوان یک بیماری مشترک در حیوانات تولید کننده غذا همچون گاومیش های رودخانه ای از نظر بهداشت عمومی از اهمیت به سزایی برخوردار است. جستجوی آنتی ژن ها یا آنتی بادی های اختصاصی ضد توکسوپلاسما گوندای در تشخیص بیماری ناشی از آن مهم است. پروتئین های نوترکیب موجب افزایش حساسیت و ویژگی و همچنین کاهش مشکلات استاندارد سازی و تکرارپذیری کیت های تشخیصی می گردد. هدف از انجام این مطالعه طراحی آزمایش الایزا با استفاده از ترکیبی از آنتی ژن های نوترکیب پروتئین گرانول متراکم 7 (tggra7) و پروتئین سوبتیلیزین مانند 1 (tgsub1) توکسوپلاسما گوندای جهت تشخیص سرمی توکسوپلاسموز در گاومیش های رودخانه ای بود. برای این منظور در ابتدا با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک مناطق دارای آنتی ژنسیته بالا در این دو پروتئین آنالیز و انتخاب شد. سپس قطعات dna انتخاب شده مربوط به این پروتئین ها تکثیر و در ناقل بیانی pet28aکلون گردید. پروتئین های نوترکیب همجوش شده با برچسب پلی هیستیدینی (6xhis-tag) در باکتری e. coliسویه bl21 (de3) بیان و سپس با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی با رزین ni-nta تحت شرایط دناچوره تخلیص گردیدند. پروتئین های gra7 (وزن ملکولی 27 کیلودالتن) و sub1 (وزن ملکولی 31 کیلودالتن) نوترکیب با روش های sds-page و وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی ضد hisg-hrpتأیید شدند. سپس آنتی ژن های tggra7و tgsub1 و ترکیب آن ها به عنوان یک مارکر بالقوه تشخیصی برای عفونت توکسوپلاسموز توسط سه الایزای غیرمستقیم شامل الایزای gra7، الایزای sub1 و الایزای ترکیبی به شکل جداگانه با استفاده از 223 نمونه سرمی گاومیش رودخانه ای مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج این سه الایزا از نظر آماری تجزیه و تحلیل و با نتایج کیت الایزای غیرمستقیم تجاری (id.vet، فرانسه) مقایسه گردید. آنالیز آماری نتایج نشان دهنده این است که هیچ اختلاف معنی داری از نظر تفکیک سرم های مثبت و منفی بین این آزمایش ها وجود ندارد (05/0< p). همچنین توافق تقریباً کامل بین هر سه الایزا و کیت تجاری مشاهده شد (آماره کاپا = 812/0، 919/0 و 874/0؛ 001/0>p ). در آنالیز آماری تعیین سطح زیر منحنی (roc) نقاط برش الایزای gra7، الایزای sub1 و الایزای ترکیبی ( به ترتیب 357/0، 2445/0 و 4115/0) به گونه ای تعیین شد که بالاترین حساسیت و ویژگی نسبی را در مقایسه با نتایج کیت تجاری داشته باشند. در این نقاط برش هر سه الایزا حساسیت نسبی 98 درصدی را در مقایسه با کیت الایزای تجاری نشان دادند. ویژگی نسبی سه آزمایش الایزا به ترتیب 3/88، 3/95 و 4/92 درصد بود. یافته های حاصل از این مطالعه نشان می دهند که tggra7 و tgsub1 مارکرهای تشخیصی امیدوارکننده ای برای تشخیص عفونت با توکسوپلاسما گوندای در گاومیش های رودخانه ای هستند. با این وجود به نظر می رسد tgsub1 به منظور استفاده به عنوان آنتی ژن در آزمایش الایزا مناسب تر باشد. الایزاهای طراحی شده از حساسیت و ویژگی بالایی برخوردار هستند، اما بایستی روی تعداد زیادتری نمونه سرمی آزمایش شوند تا قابل اعتماد بودن و تکرارپذیری آن ها جهت تشخیص سرمی توکسوپلاسموز در گاومیش های رودخانه ای ارزیابی شود.