ساب کلونینگ و مقایسه ی فعالیت نوع طبیعی آنزیم تیروزیناز انسانی با انواع جهش یافته ی آن (m374t و m374d) در رده ی سلولی hek-293

آنزیم تک زنجیره ای حاوی مس تیروزیناز، یک گلیکوپروتئین غشایی نوع i است که به گروه پروتئین های وابسته به مس نوع 3 تعلق دارد. این آنزیم در جایگاه فعال خود دارای دو اتم مس است که هریک توسط سه ریشه ی بسیار حفظ شده ی هیستیدین در موقعیت مناسب برای واکنش قرار می گیرند. تیروزیناز انسانی از اکسیژن ملکولی برای انجام دو مرحله ی اول مسیر سنتز ملانین یعنی ارتو-هیدروکسیلاسیون l-تیروزین به l-دوپا (فعالیت تیروزین هیدروکسیلازی) و اکسیداسیون متعاقب آن ها به دوپاکینون (فعالیت دوپا اکسیدازی) استفاده می کنند. در پژوهش قبلی این آنزیم برای به دست آوردن نوع جهش یافته ی دارای فعالیت دوپا اکسیدازی بیشتر مورد مهندسی پروتئین قرار گرفت. m374 یک ریشه ی بسیار حفظ شده در خانواده ی پروتئین های مس نوع 3 است که در جایگاه فعال تیروزیناز انسانی قرار گرفته است. این اسید آمینه در پژوهش قبلی با چهار اسید آمینه ی ترئونین (m374t)، آسپارتیک اسید (m374d)، لیزین (m374k) و آرژینین (m374r) تعویض شد و فعالیت اختصاصی آنزیم نوترکیب و این چهار جهش یافته در سویه ی e.coli bl21 مورد بررسی قرار گرفت. مشخص شد که دوجهش یافته ی اول فعالیت دوپا اکسیدازی بالاتری نسبت به نوع نوترکیب آنزیم دارند. در پژوهش کنونی، آنزیم نوترکیب به همراه دو جهش یافته ی اول به عنوان مدلی برای بررسی فعالیت دوپا اکسیدازی تیروزیناز انسانی در رده ی سلولی hek-293 بیان شدند. توالی های رمز کننده ی تیروزیناز پیشتر در حامل pet-28a(+) کلون شده بودند. قدم اول سابکلون قطعات رمز کننده ی تیروزیناز طبیعی و انواع جهش یافته m374d و m374t در pcdna3.1/his/lacz بود. برای معادل سازی تولید پروتئینی با شرایط تاخوردگی مشابه در تروزیناز های یوکاریوتی، توالی رمز کننده ی lacz به طور کامل خارج شده و توالی های رمز کننده تیروزیناز بدون حضور سیگنال نشانه به جای آن کلون شدند. برای تهیه میزان کافی از واریانت های آنزیمی مورد نظر برای اندازه گیری های بیوشیمیایی، نزدیک به 9 میلیون سلول hek293 با هر واریانت ترانسفکت شد. پس از گذشت نزدیک به 30 ساعت از زمان ترانسفکشن، هرنمونه با استفاده از بافر لیز-اتصال، لیز شد و محتویات آن با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شدند. فعالیت آنزیمی هیچ یک از نمونه ها قابل تشخیص نبود. برای کمک به تاخوردگی بهتر انواع آنزیمی، مراحل ترانسفکشن، لیز و خالص سازی همانند آنچه شرح داده شد، مجدداً انجام گشت. تنها تفاوت افزوده شدن l-dopa استریل با غلظت نهایی 1 mm به سلول ها بود. این بار نیز فعالیت آنزیمی قابل تشخیصی مشاهده نشد. تمام مراحل فوق بار دیگر تکرار شد و l-dopa با cuso4 با غلظت نهایی ?m 100 جایگزین شد. از آنجایی که فعالیت آنزیمی مشاهده نشد، حضور احتمالی یک مهار کننده در مراحل مختلف بررسی شد. مشخص شد که nacl مهار کننده تیروزیناز بوده و قادر به مهار کامل فعالیت تیروزیناز در غلظت ?m 800 می باشد. به همین منظور به جای خالص سازی نمونه های آنزیمی، فعالیت نسبی نمونه-های مختلف بررسی گشت. کلیه مراحل لیز سلول های ترانسفکت شده در داخل بافر pbs محتوی تریتون x-100 و مهار کننده ی پروتئاز انجام شد. پس از بررسی نمونه ها، جذب در محدوده ی 03/0-02/0 برای تمامی نمونه ها مشاهده شد که به دلیل پایین بودن مقادیر مشاهده شده نمی توان با اطمینان کامل آن را مرتبط به فعالیت دوپا اکسیدازی دانست. برای اطمینان از بیان مناسب سازه ها rt-pcr نیمه کمی در سطح rna و آنالیز وسترن بلات در سطح پروتئین انجام شد که نشان دهنده ی تولید شدن تمامی نمونه های آنزیمی در هر دو سطح بود. آنالیز وسترن بلات غلظت بسیار پایینی از تمامی نمونه ها نشان دارد. به همین دلیل اندازه گیری فعالیت آنزیمی نیازمند تهیه رده های سلولی که دائماً واریانت های مختلف آنزیم را تولید کنند است و کشت این رده های سلولی در حجم های بیشتر باید انجام گیرد که شامل حداقل 20 میلیون سلول در حال کشت برای هر نمونه می شود.