اثر انجماد شیشه ای رویان موش بر بیان ژن های ایمپرینت شده و آنزیم های درگیر در متیلاسیون dna

اپی‏ژنتیک فعالیت ژن را بدون تغییر در رمزهای ژنتیکی تنظیم می‏کند. متیلاسیون dna نقش مهمی را در تغییرات اپی‏ژنتیکی ایفا می نماید. اووسیت و رویان طی تکوین طبیعی خود دستخوش تغییرات اپی ژنتیکی گسترده ای می گردند. عوامل محیطی طی اوایل تکوین در پستانداران نقش تعیین کننده‏ای را در تنظیم اپی‏ژنتیکی بر عهده دارد. بنابراین ارزیابی جزییات اثر روش‏های کمک تولید مثلی بر ژنتیک، اپی‏ژنتیک و فنوتیپ در ارتباط با تنظیم اپی‏ژنتیکی گسترده در ژنوم، طی تکوین اولیه رویان اهمیت ویژه‏ای دارد. در این رساله به بررسی اثرات روش‏های کمک تولید مثلی بر بیان ژن های موثر بر وضعیت متیلاسیون dna و ژن های ایمپرینت شده در دو مرحله پیش از لانه گزینی و پس از آن پرداخته شده است. در دو آزمایش اول، چهار گروه تیماری شامل گروه شاهد، گروه سوپراووله، گروه سوپر اووله+ کشت (گروه کشت) و گروه سوپراوله+ انجماد شیشه ای+ کشت (گروه انجمادی) انتخاب و مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که نرخ بلاستوسیست و بلاستوسیست تفریخ شده در گروه انجمادی نسبت به گروه کشت به طور معنی داری پایین تر بود (01/0>p). شدت نور فلورسنت 5-متیل سیتوزین و بیان ژن dna متیل ترانسفراز 1 در گروه شاهد به طور معنی داری بیشتر از گروه انجماد شیشه ای بود (05/0>p). در مجموع میزان بیان هر سه ژن dna متیل ترانسفراز در گروه های شاهد و سوپراووله تفاوت معنی داری با یکدیگر نداشتند. همین وضعیت نیز برای گروه های کشت و انجمادی مشاهده شد. بیان چهار ژن از پنج ژن ایمپرینت شده نیز تحت تأثیر یک، دو و یا هر سه تکنیک تولید مثلی قرار گرفت. ممکن است سوپراوولاسیون باعث آزادسازی اووسیت های غیرطبیعی گردد. این اتفاق از طریق وادار کردن اووسیت ها برای تکوین خیلی سریع و یا آزاد شدن اووسیت هایی که از قبل برای پس روی کردن انتخاب شده اند، صورت می گیرد. بنابراین، این اووسیت ها ممکن است در توانایی حفظ وضعیت متیله و بیان ژن های ایمپرینت شده با مشکل مواجه باشند. همچنین تزریق اگزوژنوسی هورمون ها می تواند باعث تغییر محیط اویداکت گردد و اثر منفی بر وضعیت ژن های ایمپرینت شده بگذارد. اما عدم وجود تفاوت معنی دار برخی ژن ها در گروه شاهد با گروه های کشت و انجمادی (با توجه به انجام سوپراوولاسیون در این دو گروه) می تواند ناشی از اثر محیط کشت بر تعدیل بیان این ژن ها و یا حذف اووسیت های با کیفیت پایین طی تکوین باشد. بلاستوسیست های حاصل از کشت آزمایشگاهی دو گروه کشت و انجمادی به موش های با آبستنی کاذب دارای سیکل طبیعی منتقل گردید. جایگاه های لانه گزینی در هر دو گروه تفاوت معنی داری را در روز 5/9 نشان ندادند. همچنین با مقایسه وزن جنین های هر چهار گروه، مشخص گردید سوپراوولاسیون باعث کاهش وزن جنین می گردد. این کاهش در گروه سوپراووله نسبت به گروه شاهد معنی داری بود (05/0>p). اما تفاوت معنی داری برای وزن جفت ها مشاهده نگردید. الگوی وزن جنین ها با الگوی بیان ژن ایمپرینت h19 در دو مرحله بلاستوسیست و 5/9 روزگی هم خوانی دارد. از آنجایی که ژن های ایمپرینت شده با بیان مادری باعث کاهش وزن می گردند، به نظر می رسد افزایش چند برابری بیان ژن h19 در گروه سوپراووله دلیل احتمالی کاهش وزن جنین های این گروه باشد. دیگر دلیل احتمالی این اتفاق را می توان به حجم محدود رحم و تعداد بالای جنین ناشی از سوپراوولاسیون مرتبط دانست. بیان سه ژن از پنج ژن ایمپرینت شده در جنین های گروه سوپراووله به طور معنی داری بالاتر از دیگر گروه ها بود (05/0>p). به نظر می رسد تزریق اگزوژنوسی هورمون ها می تواند باعث تغییر محیط اویداکت و رحم گردد و اثر منفی بر وضعیت ژن های ایمپرینت شده داشته باشد. در آزمایش سوم اثر ناک داون کردن ژن dppa3 در مرحله جرمینال وزیکولی اووسیت گاوی بر وضعیت متیلاسیون dna بررسی گردید. در سطح اپی ژنتیکی dppa3 مانع اکسیداسیون 5mc به 5hmc می گردد و در شکل گیری غیرمتقارن کروماتین والدینی نقش دارد. ناک داون کردن dppa3 در اووسیت های گاوی منجر به افزایش سطح 5hmc در پیش هسته مادری و ایجاد الگوی متقارن بین پیش هسته های والدینی گردید. همچنین توان تکوین اووسیت های این گروه به طور معنی داری پایین تر از گروه های شاهد بود (05/0>p). این نتایج نشان می دهد که dppa3 نقش مهمی را در جلوگیری از اکسیداسیون 5mc به 5hmc در پیش هسته مادری گاو و توان تکوین رویان ایفا می کند.