ردیابی ژن filia و پروتئین آن در تخمدان و تخمک گاو

فیلیا یکی از ژن های مادری است که بر نرخ باروری موثر است. پروتئین فیلیا در موش باعث تفکیک مناسب کروموزوم ها در رویان می-شود و همچنین در یک مجموعه ی پروتئینی در ناحیه ی زیر کورتکسی تخمک و رویان موش حضور دارد که بر تکامل رویانی موثر است. در این تحقیق به کمک محیط کشت بهینه سازی شده برای کشت آزمایشگاهی رویان گاو جهت تامین منابع استخراج rna، بیان ژن فیلیا در سطح mrna مورد بررسی قرار گرفت. تخمک ها از تخمدان های گاوهای کشتارشده جمع آوری شد و تعدادی از آن ها به صورت آزمایشگاهی بالغ شد. از این تعداد بخشی وارد مرحله ی لقاح آزمایشگاهی شد و در نهایت در محیط های کشت یک و دو-مرحله ای بهینه سازی شده با 100 نانوگرم در میکرولیتر مکمل egf تا مرحله ی بلاستوسیست کشت داده شد. استخراج rna از تخمدان، اویداکت، شش، قلب، کبد و جنین 40-30 روزه ی گاو، تخمک نابالغ، تخمک بالغ شده، رویان های دو، چهار و هشت تا 16 سلولی و بلاستوسیست انجام شد. انتهای5 توالی پیش بینی شده ی رونوشت فیلیا در ncbi با توالی مشابه آن در انسان بلاست گذاشته شد و طراحی آغازگر از روی ناحیه ی حفاظت شده ی آن برای تکثیر یک قطعه با 164 جفت باز صورت گرفت. همچنین آغازگر دیگری برای تکثیر 443 جفت باز از بخش داخلی تری از رونوشت فیلیا طراحی شد. واکنش pcr برای فیلیا انجام شد و قطعه ی مورد نظر تعیین توالی شد. برای تعیین اندازه ی کل توالی رونوشت فیلیا، بررسی بیوانفورماتیک و آزمایش 3?race-pcr انجام شد. جهت مقایسه ی میزان بیان در مراحل مختلف تخمک و رویان، آزمایش real-time pcr صورت گرفت. برای بررسی بیان پروتئین فیلیا، پپتید فیلیا برای تولید آنتی بادی در یک برنامه ی زمانی دوماهه به خرگوش تزریق شد. سرم به کمک آزمایش های دات بلات و الایزا برای تعیین اختصاصیت مورد تایید قرار گرفت. آزمایش ایمونوفلورسنس با آنتی بادی اولیه علیه فیلیا روی بافت های تخمدان، اویداکت و رحم گاو و همچنین تخمدان گوسفند انجام شد. نتایج rt-pcr نشان داد نسخه های فیلیا تنها در تخمدان و مراحل مختلف تکاملی از تخمک نابالغ تا رویان در مرحله ی بلاستوسیست وجود دارد. واکنش 3race-pcr نشان داد تنها یک قطعه با 1600 جفت باز تکثیر شد و قطعه ی کوچک تری مشاهده نشد. بررسی ژن فیلیا و پروموتر فرضی آن نشان داد تنها یک جایگاه شروع رونویسی در نوکلئوتید 94- بالادست کدون آغاز قرار دارد و این ژن دارای سه اگزون است و احتمال می رود که mrna فیلیای گاو تنها یک واریانت داشته باشد. این نتایج، اختلافات میان نشخوارکنندگان و جوندگان را نشان می دهد. بیان ژن فیلیا در مرحله ی تخمک بالغ و رویان دو و چهارسلولی تغییر معنی داری نسبت به تخمک نابالغ نشان نداد. بیان ژن در مرحله ی هشت تا 16-سلولی به طور معنی داری افزایش و در بلاستوسیست با نسبت قابل توجهی کاهش یافت. افزایش بیان در مرحله ی هشت تا 16-سلولی، بیان رویانی فیلیا و نیاز بحرانی رویان را به این نسخه در تقسیم چهارم سلولی نشان می دهد. بررسی ایمونوفلورسنس نشان داد پروتئین فیلیا تنها در سیتوپلاسم تخمک گاو بیان می شود و در گوسفند، بیان آن به ناحیه ی زیر کورتکسی تخمک محدود می شود. با توجه به این که پروتئین فیلیا در موش باعث تفکیک مناسب کروموزوم ها در رویان می شود و بر باروری موثر است، احتمال می رود این پروتئین نقش مشابهی در نشخوارکنندگان داشته باشد.