کلون کردن، بیان ژن t4 dna لیگاز در میزبان اشرشیاکلی و خالص سازی آنزیم t4 dna لیگاز

در طول ?? سال اخیر، کشف آنزیم¬هایی که امکان کلون کردن ژن¬ها را فراهم می¬کنند سبب پیشرفت قابل توجهی در زمینه¬ی زیست¬شناسی مولکولی شده است. یکی از آنزیم¬های مهم در این زمینه آنزیمdna t4لیگاز می¬باشد که به دلیل کاربرد فراوان در فرآیند همانندسازی، ترمیم، ساخت پلاسمیدهای نوترکیب، اتصال سازگارکننده¬ها و اتصال دهنده¬ها به مولکول با انتهای متقارن و آنالیز بیان ژن مورد توجه محققان قرار گرفته است. این آنزیم ناپیوستگی¬های موجود در اسکلت dna را با ایجاد پیوند فسفو دی استر بین انتهای ?? فسفات و ?? هیدروکسیل در یک واکنش چند مرحله¬ای وابسته به آدنوزین تری فسفات به هم متصل می¬کند. در این تحقیق حامل¬های بیانی ptrchis-t4 و pet28-t4 به طور جداگانه در باکتری¬های اشرشیاکلی مستعد، سویه¬های dh5?، top10f، bl21(de3) انتقال داده شد و پس از تائید ترانسفورماسیون، از کلون¬های حاوی حامل¬های ژن dna t4لیگاز برای بیان پروتئین نوترکیب استفاده گردید. برای بیان پروتئین نوترکیب از غلظت نهایی 1 میلی مولار ماده القاء کننده iptg استفاده، 5 ساعت بعد از القاء، سلول¬های مورد نظر رسوب داده شدند و در مرحله تخلیص، پروتئین-های بیان شده حاوی توالی هیستیدین، توسط ستون نیکل آگارز ساخت شرکت کیاژن خالص گردید و سپس میزان خلوص آن¬ها از روی ژل sds-page مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده نشان داد که خلوص پروتئین¬های نوترکیب بیش از 90 درصد و بیشترین بیان پروتئین برای حامل pet28-t4 مربوط به باکتری اشرشیاکلی سویه bl21(de3) و برای حامل ptrchis-t4 مربوط به باکتری اشرشیاکلی سویه top10f می¬باشد.