شناسایی پروتئین fha-like در acinetobacter baumannii، نقش آن در بیماریزایی و ایمنی زایی

مقدمه: پروتئین های وابسته به خانواده سیستم ترشحی دوجزئی می توانند درچسبندگی باکتری نقش داشته باشند. چسبندگی برروی سطوح، به عنوان یک عامل بیماریزایی، اولین گام در انجام فرایند تجمع باکتریایی می باشد. اسینتوباکتربومانی دارای توانایی ویژه ای برای کلونیزاسیون برروی سطوح مختلف است. هدف از انجام این تحقیق، شناسایی، مطالعه و بررسی نقش پروتئین های این خانواده در چسبندگی اسینتوباکتربومانی به سلول اپی تلیال انسانی و تشکیل بیوفیلم است. مواد و روش: در این مطالعه ابتدا هومولوگ ژن های کد کننده پروتئین چسبندگی، وابسته به سیستم ترشحی دوجزئی در ژنوم اسینتوباکتربومانی با کمک نرم افزارهای بیوانفورماتیک در بانک ژنی آنالیز و سپس آغازگرها طراحی شدند. دو ادهسین غشای خارجی مشابه به پروتئین های fha که ترکیبی از اگزوپروتئین fhab (fhab1 & fhab2) و پروتئین کانال fhac (fhac2 & (fhac1 است، همسانه سازی شدند. بیان هر یک از اگزوپروتئین ها و کانال مربوط به آن (fhab1& fhac1) و(fhab2&fhac2) تحت کنترل دو پروموتور مجزا در یک سلول به نام fhab1c1 و fhab2c2 و همچنین هریک در سلول مجزا fhab1 و fhab2 مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان بیان پروتئین های مورد مطالعه در سطح غشای خارجی سلول باکتری ارزیابی شد. سپس ژن های کد کننده پروتئین های کانال fhac1 و fhac2 جهش یافته و همراه با اگزوپروتئین مرتبط خود به سلول اشریشیاکلی bl21de3 ترانسفورم شدند. محصول این ترانسفورم به نام سلول های mfhab1c1 و mfhab2c2 نام گذاری شدند. توانایی چسبندگی به سلول های اپی تلیال انسانی این سویه های نوترکیب با سویه های جهش یافته و اسینتوباکتربومانی در شرایط آزمایشگاهی مقایسه شد. همچنین توانایی تشکیل بیوفیلم روی سطوح غیرزنده در سویه های جهش یافته با اسینتوباکتربومانی، fhab1c1، fhab2c2 مقایسه شدند. در مرحله بعد پروتئین کایمر(k) که ترکیبی از منطقه آنتی ژنی درقسمت های حفاظت شده اگزوپروتئین (b) و کانال (c) است، سنتز شد. از آنتی بادی علیه پروتئین کایمر برای شناسایی بیان پروتئین های نوترکیب تولید شده در آزمایشگاه، استفاده شد. سپس موش های ایمن شده با هر یک از پروتئین های کانال، اگزوپروتئین و کایمر در برابر اسینتوباکتربومانی وfhab1c1 چالش یافتند. یافته ها ونتایج: دو محصول ژنی از پروتئین های سیستم ترشحی دو جزئی اسینتوباکتربومانی atcc19606 شناسایی شده، به نام اگزوپروتئین fhab2) و fhab1 ) و کانال(fhac1و(fhac2 شناخته شده اند. دو هومولوگ پروتئین fha ، fhab1 با وزن مولکولی 110کیلودالتون و fhab2 با وزن مولکولی 190 کیلودالتون حدودا 48% تشابه دارند که به دلیل حضور موتیف چسبندگی npgx است که در تشکیل بیوفیلم نقش دارد. قرار گرفتن اگزوپروتئین در سطح غشای خارجی سلول به روش الایزای سلول کامل و وسترن بلات تایید شده است. سلول های جهش یافته mfhab1c1,mfhab2c2 فاقداگزوپروتئین fhab در سطح غشای خارجی است. بیان اگزوپروتئین در سلول fhab1c1 سبب افزایش چسبندگی سویه های نوترکیب به سلول های اپی تلیال ریه a549 و helaمی شود. نتایج آزمایشات نشان داده است که fhab1 سبب افزایش چسبندگی باکتری و تشکیل بیوفیلم می شود. تشکیل بیوفیلم روی سطوح پلی استرن در سویه های fhab1c1 و fhab2c2 بیشتر از سایر گروه ها بوده است. سویه های هیدروفوبیک ظرفیت بیشتری برای تشکیل بیوفیلم نشان داده اند. ایمنی زایی با پروتئین های نوترکیب b و k حیوان را در برابرآلودگی اسینتوباکتربومانی و fhab1c1 حفاظت می کند. بحث: دمین fha نقش بسیار مهمی در تشکیل بیوفیلم و چسبندگی اسینتوباکتربومانی به بافت و شکل گیری بیوفیلم ایفاء می کند و بر اساس نتایج این مطالعه اگزوپروتئین های وابسته به سیستم ترشحی دو جزئی می تواند در ایمنی زایی فعال و غیر فعال بر علیه اسینتوباکتربومانی بکاررود.