ردیابی ملکولی ویروس های onion yellow dwarf potyvirus (oydv) و (leek yellow stripe potyvirus (lysv با روش rt-pcr در سیر جندق allium sativum jandagh و تولید گیاهان عاری از ویروس با استفاده از کشت گنبد طبق ساقه

سیر (allium sativum) یک سبزی مهم اقتصادی با کاربردهای دارویی و غدایی مختلف است که در اکثر نقاط دنیا کشت مر شود. این گیاه به علت عقیم بودن گلها و عدم امکان تولید بذر، به صورت غیر جنسی و بوسیله کاشت سیرچه های بذری تکثیر می گردد. تکثیر سیر به صورت رویشی، باعث تجمع ویروس ها در مواد گیاهی می شود. از جمله مهم ترین این ویروس ها دو ویروس onion yellow dwarf potyvirus (oydv و leek yellow stripe potyvirus (lysv می باشند. در این تحقیق، گیاهان سیر آلوده دارای برگ هائی با خطوط نواری سبزرد از مزارع منطقه جندق (شمال شرق اصفهان) جمع آوری شدند. از برگ های دارای علائم ویروسی mrna کل، استخراج شد و به عنوان الگو در واکنش rt-pcr به کار رفت. در این واکنش از آغازگرهای دژنره طراحی شده از ناحیه انتهای 3 ژن nib و ناحیه میانی ژن پروتئین پوششی پوتی ویروس ها (جفت آغازگر pi و p2) و آغازگرهای اختصاصی ژن پروتئین پوششی lysv (جفت آغازگر p3 و p4) تکثیر قطعاتی با اندازه تقذیبی 500bp , 600bp با استفاده از جفت آغازگر p1 و p2 ، آلودگی نمونه های جمع آوری شده را به ترتیب به ویروس های oydv و lysv تایید نمود. آلودگی این نمونه ها به ویروس lysv، با تکثیر باند حدود 350bp با استفاده از جفت آغازگر p3 و p4 مجددا به اثبات رسید. محصولات pcr، همسانه سازیو توالی شدند. مقایسه توالی نوکلئوتیدی جدایه های oydv و lysv جندق به کمک ابزار جستجوی blast با توالی های موجود در بانک ژن، تشابه بالای آن ها با توالی های گزارش شده این دو ویروس از سایر نقاط جهان نشان داد. مقایسه توالی آمینواسیدی نواحی 5 و میانی ژن پروتئین پوششی جدایه های oydv و lysv جندق با توالی نواحی متناظر تعدادی از جدایه های موجود در بانک ژن، تشابه بالای این ویروس ها را به ترتیب با جدایه jinxiang چین (2/93%) و جدایه تایوان (1/80%) مشخص نمود. به منظور حذف ویروس های oydv و lysv از روی کشت گنبد طبق روی محیط پایه ls استفاده شد. نتایج بهینه سازی کشت طبق، اختلاف معنی داری در سطح 1% بین تیمار تنظیم کننده های رشد 1- نفتالین استیک اسید و 6- بنزیل آمینوپورین به ترتیب با غلظت های 1/0 و یک میلی گرم در لیتر با سایر تیمارها، روی رشد گیاهچه های درون شیشه ای، نشان داد. پنج هفته پس از کشت درون شیشه، گیاهچه های تولیدی با استفاده از rt-pcr به کمک آغازگرهای p1/p2 و p3/p4 مورد آزمون قرار کرفتند. نتایج rt-pcr حذف ویروس های فوق را از گیاهان آلوده اثبات نمود و نشان داد که کشت گنبد طبق روشی کارا و مطمئن برای حذف ویروس های lysv و oydn و احتمالا سایر ویروس ها در سیر و جایگزین مناسبی برای روش مشکل و زمان بر کشت مریستم انتهائی می باشد.