استخراج آنزیم همولیزین از باسیلوس ها و بررسی خواص آن از طریق بیوانفورماتیک

چکیده همولیزین یک پروتئین خارج سلولی است که توسط بسیاری از باکتری های بیماری زا و غیر بیماری زا ترشح می شود. امروزه قارچ های ترشح کننده همولیزین نیز شناسایی شده اند. این سم از طریق تجزیه گلبول های قرمز خونی در شرایط آزمایشگاه شناخته شده است. سطح فعالیت آنها غشای پلاسمایی گلبول های قرمز خون می باشد. بسیاری از همولیزین ها، جزء سموم ایجاد کننده ی حفره درغشاء می باشند که به سطح سلول متصل و اولیگومریزه شده و ساختار های حفره ای شکل را در غشاء پلاسمایی سلول های یوکاریوتی ایجاد می کند. اتصال به غشاء غلظت موضعی سم را افزایش داده و باعث تغییر پیکربندی و در نتیجه تسهیل در اولیگومریزاسیون آن می گردد. همولیزین جزء سموم وابسته به کلسترول می باشد یعنی کلسترول را به عنوان گیرنده بر روی سطح سلول های خونی شناسایی کرده و از طریق آن به سلول هدف متصل می شود پس از اتصال مونومر های سم به غشاء، اولیگومریزاسیون مونومرها به صورت حفره های تراغشایی انجام می گیرد که باعث تسهیل نفوذ کنترل نشده ی آب، یون ها و مولکول های آلی کوچک، خروج سریع مولکول های حیاتی مانند atp، از بین رفتن پتانسیل غشاء و شیب یونی، تغییر پتانسیل اسمزی و در نهایت تورم و تجزیه گلبول های قرمز خون میزبان می گردد. اهدافی که در این تحقیق دنبال می شوند عبارتند از: بررسی باسیلوس های تولیدکننده ی همولیزین و شناسایی آن ها به روش-های بیوشیمیایی و مولکولی، بررسی باسیلوس هایی با قویترین همولیزین ها و جداسازی بهترین سویه ها، زایموگرافی آنزیم استخراج شده، تعیین وزن مولکولی آن، بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی با استفاده از وبگاه های بیوانفورماتیکی، تعیین جایگاه اتصال این سم با غشاء و شناسایی اسید های آمینه درگیر در این اتصال با استفاده از نرم افزار اتوداک و استفاده از این پروتئین در پایداری لیپوزوم های حامل دارو با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی. در هنگام غربالگری باسیلوس ها، سویه m3 بهترین سویه تجزیه کننده ی خون در محیط آگار خون دار شناخته شد. سپس همولیزین تولیدی توسط این باکتری استخراج گردید و با استفاده از زایموگرافی خصوصیات لیز کنندگی آن در محیط آگار خون دار بررسی شد و در نهایت با استفاده از ژل sds-page وزن مولکولی آن تعیین گردید. از آنجا که توالی کامل سویه ی m3 شناسایی نشده است و ژن همولیزین آن مشخص نمی باشد، برای انجام کار های بیوانفورماتیک سویه ای به نام باسیلوس پامیلوسsafr032 با شباهت 99% انتخاب گردید و بر روی همولیزین این سویه در محیط in silico مراحل بعدی این پژوهش انجام گرفت. اسید های آمینه درگیر در اتصال همولیزین و کلسترول، تعداد پیوند هیدروژنی و بهترین شکل فضایی در این اتصال با استفاده از نرم افزار اتوداک شناسایی و معرفی گردید و برای شبیه سازی این پروتئین در غشا های زیستی از نرم افزار گرومکس استفاده شد. هدف از این شبیه سازی بررسی پایداری این پروتئین در غشا های زیستی و همچنین مطالعه پایداری غشاء لیپیدی بعد از ورود این پروتئین به داخل غشاء می باشد. نتایج شبیه سازی مولکولی نشان داد در اثر برهمکنش های بین همولیزین و لیپید های غشاء این شبیه سازی بر روی ساختار همولیزین هیچ تاثیری ندارد و می توان از همولیزین به عنوان عاملی در پایداری غشاء لیپیدی استفاده کرد.