ارزیابی پرایمرهای مختلف جهت جستجوی باکتری بروسلا از نمونه های سرم انسان و دام با استفاده از روش pcr

روش pcrیک روش سریع، حساس، دارای ویژگی بالا و کم هزینه برای تشخیص پاتوژن ها می باشد و می تواند بر روش های معمول تشخیص غلبه کند. سرم به علت کاهش شدید در مهار کننده های pcr نمونه مناسب برای تشخیص بروسلوز می باشد. هدف از این مطالعه ارزیابی سه جفت پرایمر پر کاربرد b4-b5، f4-r2 و jpf-jpr، برای تشخیص بروسلوز از نمونه های سرم دام و انسان به روش pcr و هم چنین تعیین حساسیت آنالیتیک پرایمرها می باشد. تعداد 38 نمونه سرم انسان و 30 نمونه سرم گوسفند در مرحله حاد بروسلوز جمع آوری گردید. یک سوسپانسیون سلولی از بروسلا آبورتوس s19 معادل با لوله 3 مک فارلند تهیه شد. رقت های سریالی 10 برابر از سوسپانسیون سلولی و از رقت های سرمی ]رقت 1همراه با سرم منفی[ تهیه شد. رقت های سرمی به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. dna به روش جوشاندن جداسازی شد. dna جدا شده از سرم به نسبت های 100/1، 200/1، 300/1 و 500/1 رقیق سازی شده و بهترین رقت برای pcr با استفاده از هر سه پرایمر تعیین شد. dna رقت های سرمی و dna نمونه های سرم به نسبت 200/1 رقیق سازی شد و pcr با استفاده از هر سه پرایمر بر روی همه رقت های باکتریایی، رقت های سرمی، رقت های 200/1 و نمونه های سرم انجام شد. مقایسه حساسیت سه پرایمر با آنالیز آماری انجام گرفت. a260/a280 حاصل از 9 نمونه توسط نانودراپ کمتر از 1 بود و بهترین رقت dna سرمی برای هر سه پرایمر 200/1 تعیین شد. از تعداد کل 68 نمونه به ترتیب 54 نمونه (41/79 درصد)، 44 نمونه (70/64 درصد) و 35 نمونه (47/51 درصد)، از نمونه های انسانی 33 نمونه ]84/86 درصد[، 27 نمونه ]05/71 درصد[ و 22 نمونه ]89/57 درصد[ و از نمونه های حیوانی 21 نمونه ]70 درصد[، 17 نمونه ]67/56 درصد[ و 13 نمونه ]33/43 درصد[ با سه جفت پرایمر b4-b5، f4-r2 و jpf-jpr مثبت بودند. b4-b5، f4-r2 و jpf-jpr به ترتیب قادر به شناسایی 9×102، 9 و 9×105 باکتری در 1ml از سوسپانسیون باکتریایی، 9×108، 9×108 و 9×108 باکتری در 1ml از سوسپانسیون سرمی و 9×104، 9×105 و 9×107 باکتری در 1ml از رقت 200/1 از رقت های سرمی بودند. تفاوت های بین نتایج برای پرایمرها در مورد نمونه های سرم انسانی و حیوانی به صورت جدا و با همدیگر معنی دار بود. نتایج نانودراپ و تشکیل اسمیر بر روی ژل از وجود مهار کننده ها حکایت داشت. در رقت 1 از dna سرمی هیچ باندی مشاهده نشد اما در رقت های 100/1 تا 500/1 قابل مشاهده بود، بنابراین بهترین کار برای حذف یا کاهش تأثیر مهار کننده ها رقت سازی dna می باشد. پرایمر b4-b5 توانست بیشترین موارد بروسلا در نمونه های سرم و تمام رقت های 200/1 از رقت های سرمی را شناسایی کند. هم چنین f4-r2 توانست تمام رقت های سریالی از باکتری خالص را شناسایی کند. بنابراین در مواقعی که روش جوشاندن برای بروسلا استفاده می شود پرایمر f4-r2 برای باکتری خالص و پرایمر b4-b5 برای سرم، دارای بیشترین حساسیت برای تشخیص بروسلا هستند. جداسازی dna توسط روش جوشاندن سبب کاهش هزینه های مربوط به pcr می شود.