بهینه سازی تولید و بررسی خواص قطعه تک زنجیره ای ناحیه متغیر آنتی بادی نشان دار با پروتئین فلورسنت سبز بر ضد گیرنده cd4 انسانی در باکتری اشرشیا کلی

پادتن ها ابزارهای قدرتمندی برای مطالعه ی عملکرد، مکان یابی و میان کنش پروتئین ها هستند. هم چنین این مولکول ها به طور گسترده برای اهداف تشخیصی و درمانی نیز به کار می روند. پادتن ها معمولاً برای اهداف تحقیقاتی و تشخیصی با مولکول های فلورسنت نشان دار می گردند. اگر مولکول فلورسنت مورد نظر یک پروتئین نوترکیب باشد در این حالت مولکول حاصل فلوبادی نامیده می شود. در این پژوهش، ابتدا قطعه ی تک زنجیره ای ناحیه ی متغیر پادتن ضد گیرنده ی cd4 انسانی که به پروتئین فلورسنت سبز متصل شده است، توسط دو آنزیم ecor? و nco? از ناقل pab1 استخراج گردید. سپس قطعه ی مورد نظر به منظور یافتن ناقل بیانی مناسب، در ناقل های pet26b و pcantab5e همسانه سازی شد و ناقل های نوترکیب ایجاد شده به منظور یافتن سویه بیانی مناسب در چندین سویه از باکتری اشرشیا کلی ترانسفورم گردیدند. ورود قطعه ی مذکور به داخل هر دو ناقل به وسیله ی واکنش کلنی-pcr و هضم آنزیمی دوگانه تأیید شد. سپس بیان اولیه ی فلوبادی با روش فلوسیتومتری بررسی گردید و بر اساس نتایج به دست آمده باکتری اشرشیا کلی سویه ی bl21 حاوی ناقل pet26b نوترکیب برای بهینه سازی تولید فلوبادی انتخاب شد. هم چنین بیان فلوبادی مذکور توسط تکنیک های sds-page، وسترن بلات، دات بلات و الیزا تأیید شد. به منظور بهینه سازی تولید فلوبادی 6 پارامتر شامل دما در سطوح 14، 18، 24 و ?c30 ، زمان های پس از القا در سطوح 6، 12، 18 و 24 ساعت، غلظت iptg در سطوح 0، 75/0، 1 و mm5/1، محیط کشت های lb و tb، درصد های مختلف اتانول و گلیسرول انتخاب شد. برای طراحی آزمایش های بهینه سازی از روش تاگوچی استفاده شد. میزان بیان فلوبادی در هر آزمایش به صورت سه بار تکرار و با روش فلوسیتومتری اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که. غلظت mm1 iptg، دمای ?c18 و زمان پس از القای 18 ساعت بیشترین تاثیر را در تولید فلوبادی داشته اند. سپس فلوبادی حاصل با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل خاص سازی شد. هم چنین در این پژوهش تولید پروتئین egfp نیز بهینه سازی شد، که بر اساس نتایج به دست آمده دمای ?c30، غلظت mm5/0 از iptg و محیط کشت lb بیشترین تاثیر را در تولید پروتئین egfp داشتند. کلمات کلیدی: فلوبادی، بهینه سازی، اشرشیا کلی، ناقل