شناسایی و جداسازی ریزماهواره های انار به منظور ارزیابی ژنوتیپ های ایرانی

انار با نام علمی punica granatum l یکی از مهمترین میوه های نیمه گرمسیری محسوب می شود که به دلیل امکان پرورش آن در مناطق وسیعی از ایران با شرایط آب و هوایی خشک و نیمه گرمسیری، از نظر اقتصادی از اهمیت خاصی برخوردار است. علاوه بر سطح بالایی از تنوع ژنوتیپی انار در ایران وجود دارد اما اطلاع دقیقی از این تنوع در دسترسی نیست و ارقام بیشتر به نام های محلی آن ها شناخته شده و بر مبنای صفات مورفولوژیک از یکدیگر متمایز می شوند. از آنجا که در بسیاری از منابع، ایران به عنوان خاستگاه اصلی انار ذکر شده است. تفکیک دقیق و تعیین روابط خویشاوندی این ارقام از اهمیت خاصی برخوردار می باشد. در این تحقیق نشانگر ریزماهواره بدلیل خصوصیاتی از جمله هم بازی، چند آللی و پراکندگی یکنواخت در طول ژنوم برای گروه بندی ارقام انار ایران مورد توجه قرار گرفت و چون تا کنون آغازگرهای ریزماهواره ای در انار طراحی نشده است، شناسایی و جداسازی مکان های ریزماهواره ای در انار مورد مطالعه قرار گرفت. از میان روش های متعددی که به منظور شناسایی و جداسازی مکان های ریزماهواره ای گزارش شده بود، روش بهینه شده edwards در سال 1996 با اعمال تغییراتی استفاده شد. اساس این روش تهیه کتابخانه ژنومی ناقص و غنی سازی آن برای بدست آوردن قطعات حاوی توالی ریزماهواره ای است. سهولت و کارایی نسبی غنی سازی در این روش از جمله مزیت های آن نسبت به سایر روش های موجود برای جداسازی ریزماهواره ها می باشد. دو کتابخانه ژنومی ناقص با دو الگوی هضم آنزیمی متفاوت (انتهایصاف و انتهای چسبنده) تهیه گردید و غنی سازی بوسیله کاوشگرهای ریز ماهواره ای gt15, ag15 و att10 انجام گرفت. پس از غنی سازی، قطعات به دام افتاده همسانه شدند. به منظور غربال نمودن حجم بالایی از همسانه های بدست آمده و تایید دقیق تر حضور توالی ریزماهواره ای در همسانه ها، روش های متفاوتی مبتنی بر دورگ سازی (دات بلات و دورگ سازی همسانه) و pcr (با آغازگر mlul یا pgem-t) مورد استفاده قرار گرفت. در نهایت از میان همسانه های تایید شده با استفاده از هر یک از روش های مذکور، همسانه هایی برار توالی یابی انتخاب شدند. نتایج توالی نشان داد کا روش دورگ سازی دات بلات از کارایی بیشتری برای غربال سازیهمسانه ها برخوردار بوده است. از میان 19 همسانه توالی یابی شده، چهار همسانه توالی ریزماهواره ا با تکرار کافی نشان داد. بر اساس نواحی مجاور توالی های ریزماهواره ای بدست آمده و با استفاده از نرم افزار الیگو، آغازگرهای a16, a18, a10 و a9 طراحی شدند. واکنش های متعددی به منظور بهینه سازر شرایط pcr برای تکثیر مناسب آغازگرهای طراحی شده در ارقام انار موجود صورت گرفت. در نهایت از میان آغزگرهای طراحی شده، آغازگر a18 توانست در بین 29 رقم انار بررسی شده در دو رقم نباتی اردکان و گرج شهوار یزد چند شکلی نشان دهد. این دو رقم نسبت به سایر ارقام هموزیگوتی نشان دادند در حالی که بقیه ارقام در این مکان ژنی هتروزیکوت بودند. آغازگر a10 در این تحقیق، آغازگری تک شکل بود و نتوانست چند شکلی در بین ارقام نشان دهد. تک شکلی آغازگرهای در بسیاری از تحقیقات بررسی شده نیز گزارش شده است. در نهایت با توجه به بهینه شدن روش شناسایی و جداسازی مکان های ریز ماهواره ای در انار، انتظار آن می رود که با طراحی آغازگرهای بیشتر در آینده بتوان از آن ها جهت سازمان دهی روابط ژنتیکی ژرم پلاسم در انار و طبقه بندی ژنوتیپ های انار ایران استفاده نمود.