بررسی امکان تشخیص باکتری های متعلق به گونه salmonella enterica زیرگونه enterica با روش pcr والکتروفورز با شیب دمایی (ttge)

پایان نامه
چکیده

salmonella، یکی از عمده ترین عوامل مسبب بیماری های ناشی از غذا می باشد که باعث بیماری های شدیدی به خصوص در کودکان، افراد پیر و بیمارانی که سیستم ایمنی آنها تضعیف گردیده، می شود. روش های تشخیصی مبتنی بر کشت و سرولوژیکی علاوه بر زمانبر بودن، به دلیل اختصاصیت و حساسیت پایین، کاربرد محدودی دارند؛ لذا جهت تضمین سلامت غذا، دستیابی به روش های دقیق تر و سریع تر برای تشخیص salmonella مورد نیاز می باشد. در این مطالعه به منظور تشخیص باکتری های مختلف گونه salmonella enterica زیرگونه enterica روش pcr و الکتروفورز با شیب دمایی (pcr-ttge) بهینه سازی شده است. روش ttge قادر به تفکیک توالی هایی که حتی در یک جفت باز متفاوت هستند، می باشد، باکتریهای استاندارد salmonella و non-salmonella بر روی محیط tsb (tryptic soy broth)در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت رشد داده شده و dna ژنومی آنها استخراج گردید. جهت مشاهده ناحیه های ذوب توالی منتخب، از نرم افزار meltingeny استفاده شد. بررسی همردیفی توالی های مورد نظر (یک ناحیه 214 جفت بازی کدکننده اندونوکلئاز غیراختصاصی) در چهار سروتایپ متعلق به این زیرگونه، تفاوت هایی را بین آنها نشان داد؛ لذا برای استفاده در این روش مناسب می باشد. در خصوص اختصاصیت آغازگرهای مربوطه، پس از بهینه سازی شرایط pcr، در ارتباط با باکتری های non-salmonella باندی مشاهده نگردید. حساسیت pcr در نمونه غذایی تلقیح شده با باکتری salmonella typhimurium، بعد از 18 ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد، cfu/ml 1 تعیین شد. چند نمونه کالباس مرغ نیز جهت تشخیص باکتری های زیرگونه salmonella با دو روش کشت و pcr مورد بررسی قرار گرفتند و آلودگی با این باکتری ها مشاهده نشد. در پایان، بهینه سازی شرایط ttge جهت تفکیک dna باکتری های استاندارد، صورت گرفت. با به کارگیری شیب دمایی 5/62 تا 5/67 درجه سانتیگراد، میزان ramp دمایی c/h?1 و الکتروفورز در ولتاژ ثابت v 130 و مدت زمان 5 ساعت، بهترین حالت تفکیک مشاهده گردید. نتایج نشان داد که نواحی تکثیر یافته حاصل از چهار باکتری salmonella در ژل آگارز 2/1% در یک سطح قرار داشته اما با ایجاد شیب دمایی مناسب، این محصولات با طول یکسان و توالی متفاوت، از یکدیگر قابل تفکیک بوده و موقعیت های متفاوتی را بر روی ژل به خود اختصاص دادند. نمونه های تلقیحی نیز به طور صحیح همسطح با باکتری های مربوطه قرار گرفتند. بنابراین پس از بهینه سازی روش pcr-ttge و تعیین الگوی باندی مشخص برای باکتری های استانداردsalmonella ، می توان به صورت مستقیم باکتری های مختلف این زیرگونه را در مواد غذایی مورد بررسی قرار داد. (ytrptic soy tsb بر روی محیط non-salmonella و salmonella . باکتریهای استاندارد ژنومی آنها استخراج dna در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت رشد داده شده و broth) استفاده شد. بررسی meltingeny گردید. جهت مشاهده ناحیههای ذوب توالی منتخب، از نرمافزار همردیفی توالیهای مورد نظر (یک ناحیه 214 جفت بازی کدکننده اندونوکلئاز غیراختصاصی) در چهار سروتایپ متعلق به این زیرگونه، تفاوتهایی را بین آنها نشان داد؛ لذا برای استفاده در این روش مناسب می- در ارتباط با باکتریهای ،pcr باشد. در خصوص اختصاصیت آغازگرهای مربوطه، پس از بهینهسازی شرایط در نمونه غذایی تلقیح شده با باکتری pcr باندی مشاهده نگردید. حساسیت non-salmonella بعد از 18 ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد، ،salmonella typhimurium با salmonella 1 تعیین شد. چند نمونه کالباس مرغ نیز جهت تشخیص باکتریهای زیرگونه cfu/ml مورد بررسی قرار گرفتند و آلودگی با این باکتریها مشاهده نشد. در پایان، بهینه- pcr دو روش کشت و باکتریهای استاندارد، صورت گرفت. با بهکارگیری شیب دمایی dna جهت تفکیک ttge سازی شرایط c/h دمایی ramp 67 درجه سانتیگراد، میزان / 62/5 تا 5 ? 130 و مدت زمان v 1 و الکتروفورز در ولتاژ ثابت 5 ساعت، بهترین حالت تفکیک مشاهده گردید. نتایج نشان داد که نواحی تکثیر یافته حاصل از چهار 1% در یک سطح قرار داشته اما با ایجاد شیب دمایی مناسب، این / در ژل آگارز 2 salmonella باکتری محصولات با طول یکسان و توالی متفاوت، از یکدیگر قابل تفکیک بوده و موقعیتهای متفاوتی را بر روی ژل به خود اختصاص دادند. نمونههای تلقیحی نیز به طور صحیح همسطح با باکتریهای مربوطه قرار گرفتند. و تعیین الگوی باندی مشخص برای باکتریهای pcr-ttge بنابراین پس از بهینهسازی روش میتوان به صورت مستقیم باکتریهای مختلف این زیرگونه را در مواد غذایی مورد ،salmonella استاندارد بررسی قرار داد.

منابع مشابه

بررسی امکان تشخیص حضور گونههای متعلق به جنس staphylococcus در مواد غذایی با روش pcr-ttge

باکتری های جنس staphylococcus مسئول تعدادی از عفونت های مهم انسانی و حیوانی، از جمله باکتریمی و یا عفونت ورم پستان می باشند. به علاوه انتروتوکسین های استافیلوکوکی، به عنوان یکی از عمده ترین عوامل مسمومیت های غذایی شناخته شده اند. گزارش های متعددی مبنی بر توانایی تولید انتروتوکسین توسط چندین گونه ی staphylococcus به خصوص انواع کوآگولاز مثبت وجود دارند. با این حال به علت نقصان روش های تشخیصی کارآ...

Molecular differentiation between Salmonella enterica subsp enterica serovar Pullorum and Salmonella enterica subsp enterica serovar Gallinarum

S. Pullorum (SP) and S. Gallinarum (SG) are very similar. They are the agents of pullorum disease and fowl typhoid, respectively, and the two diseases are responsible for economic losses in poultry production. Although SP and SG are difficult to be differentiated in routine laboratory procedures, the ability to metabolize ornithine is a biochemical test that may be used to achieve this aim. Whi...

متن کامل

An optimized affordable DNA-extraction method from Salmonella enterica Enteritidis for PCR experiments

In diagnostic and research bacteriology settings with budget and staff restrictions, fast and cost-effective genome extraction methods are desirable. If not inactivated properly, cellular and/or environmental DNA nucleases will degrade genomic material during the extraction stage, and therefore might give rise to incorrect results in PCR experiments. When crude cell extracts, proteinase K–treat...

متن کامل

Detection of Salmonella enterica Serovar Typhimurium from Avians Using Multiplex-PCR

Salmonella enterica serovar Typhimurium and S.enterica serovar Enteritidis are the most frequently isolated serovars from food-borne diseases throughout the world. According to their antigenic profiles, salmonella shows different disease syndromes and host specificities. It is necessary and important to discriminate salmonella serovars from each other in order to ensure that each pathogen and i...

متن کامل

Biofilms of Salmonella enterica

Salmonella enterica (S. enterica) can form multicellular structures, commonly called biofilms, on various occasions. Biofilms can be formed on diverse surfaces/interfaces such as at the epithelial cell layer of a vertebrate host, on plant surfaces, or on abiotic surfaces, at the air–liquid interface and on gallstones. In this way, S. enterica is thought to achieve environmental persistence, tra...

متن کامل

Salmonella enterica serovar Typhimurium typing by prophage-specific PCR.

Recent data from microarray analysis have shown that integrated prophages are the most frequent sources of genomic variation between different strains of Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium). This led us to hypothesize that PCR detection of the integrated prophages might be an efficient typing tool that could be used as an alternative to PFGE. In this study, we optimized fou...

متن کامل

منابع من

با ذخیره ی این منبع در منابع من، دسترسی به آن را برای استفاده های بعدی آسان تر کنید

ذخیره در منابع من قبلا به منابع من ذحیره شده

{@ msg_add @}


نوع سند: پایان نامه

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه فردوسی مشهد - دانشکده علوم

میزبانی شده توسط پلتفرم ابری doprax.com

copyright © 2015-2023