مقایسه کمی و کیفی پروتئین بذر ارقام مختلف گندم با استفاده از نشانگرهای آیزوزایم

گندم نان به عنوان یک گیاه استراتژیک در راستای ترویج امنیت غذایی در سراسر جهان و به ویژه در ایران محسوب می شود. پروتئین های ذخیره ای بذر گندم به خصوص زیرواحدهای گلوتنین با وزن مولکولی بالا (hmw-gs) از عمده عوامل موثر بر کیفیت نان می باشند. به منظور مقایسه صفات کمی و کیفی پروتئین های ذخیره ای بذر (تنوع زیرواحدهای گلوتنین سنگین)، 25 رقم گندم های نان ایرانی و استرالیایی با استفاده از روش الکتروفورز ژل اکریل آمید با سدیم دودسیل سولفات (sds-page) مورد مطالعه قرار گرفتند. آزمایش در شرایط آب و هوایی بیرجند در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی در سه تکرار انجام گرفت. صفات کمی اندازه گیری شده شامل وزن هزاردانه، طول بذر، عرض بذر، ارتفاع سنبله و تعداد سنبلچه در سنبله بودند. صفات کیفی شامل درصد پروتئین، حجم رسوب زلنی، ارتفاع رسوبsds ، حجم نان، سختی دانه، میزان جذب آب و درصد رطوبت براساس استانداردهای بین المللی aacc بودند. نتایج نشان داد که در مکان ژنی glu-a1، 52 درصد از ارقام دارای زیر واحد*2، 36 درصد زیر واحد نول و 12 درصد دارای زیر واحد 1 بودند. در مکان ژنی glu-b1، زیرواحد 8+7 و 16+13 به ترتیب با 40 و 8 درصد بیشترین و کم ترین فراوانی را داشتند. در مکان ژنی glu-d1، 40 درصد ارقام دارای زیر واحد 10+5 و 60 درصد بقیه دارای زیرواحد 12+2 بودند. نتایج حاصل از تجزیه رگرسیون گام به گام نشان داد که صفت عرض دانه 50 درصد از تغییرات درصد پروتئین را توجیه می کند. تجزیه خوشه ای براساس روش وارد، برای صفات کمی و درصد پروتئین، ارقام را به دو گروه منتسب کرد، به-طوری که ارقام استرالیایی در یک گروه جدا نسبت به سایر ارقام قرار گرفتند. میانگین درصد پروتئین در ارقام استرالیایی به طور معنی داری بیشتر از ارقام ایرانی بود. تجزیه خوشه ای براساس صفات کمی و کیفی و زیرواحدهای گلوتنین، ارقام را در سه گروه منتسب کرد. ارقام گروه سوم شامل سه رقم استرالیایی با امتیاز کیفیت 10 از 10 و هفت رقم رایج کشت ایرانی شامل استار (امتیاز هفت از 10)، بزوستایا، نیک نژاد، رسول، اترک (امتیاز نه از 10)، وری ناک و زرین (امتیاز 10 از 10) برتر از دو گروه دیگر بودند. براساس تجزیه همبستگی، درصد پروتئین با وزن هزاردانه، ارتفاع سنبلچه و عرض بذر همبستگی منفی و معنی داری داشت. ارتفاع رسوب sds با وزن هزاردانه همبستگی منفی و معنی دار اما با حجم رسوب زلنی و سختی دانه همبستگی مثبت و معنی داری داشت. براساس مقایسات میانگین، بهترین ارقام با زیرواحدهای 1 یا *2 در مکان ژنی glu-a1، 16+13 یا 18+17 در مکان ژنی glu-b1 و 10+5 در مکان ژنی glu-d1 انتخاب شدند که بالاترین مقدار پروتئین، ارتفاع رسوب sds، حجم رسوب زلنی، سختی دانه و کم ترین وزن هزاردانه و عرض بذر را داشتند. براساس نتایج این مطالعه می-توان گفت ارقام استرالیایی با بذر بیشتر، وزن هزاردانه و عرض بذر کمتر، میزان پروتئین بیشتری نسبت به ارقام ایرانی دارند. براساس نتایج الکتروفورز پروتئین های ذخیره ای بذر، ارقام استرالیایی به دلیل داشتن زیرواحدهای برتر و صفات کیفی مناسب، نسبت به ارقام ایرانی برتر بودند. لذا بهتر است از ارقام ایرانی زرین، روشن، وری ناک، پیشتاز، هامون، هیرمند و شاه پسند جهت کشت و تلاقی با ارقام استرالیایی در جهت بهبود صفات کمی و کیفی گندم در برنامه های به زراعی و به نژادی استفاده شود. افزایش عملکرد گیاهان زراعی یکی از اهداف مهم امروزی برای هماهنگی با افزایش جمعیت جهان است. جمعیت جهان با نرخ رشد 6/1 تا 7/1 درصد در حال افزایش است و همه ساله 95 میلیون نفر به مصرف کنندگان محصولات کشاورزی افزوده می شود، به طوری که شائو و همکاران (2005) بیان کرده اند که یکی از راه های تأمین نیاز غذایی جمعیت درحال افزایش کشور و جهان افزایش تولید محصولات کشاورزی است و بایستی تا سال 2020 میلادی عملکرد گندم هر ساله در حدود 6/1 درصد افزایش یابد. فرآورده های گندم در الگوی غذایی مردم ایران از اهمیت زیادی برخوردار است، به طوری که 40 تا 45 درصد کالری و حدود 50 درصد پروتئین مورد نیاز روزانه هر فرد را تأمین می نماید (ایران نژاد و شهبازیان، 2005). به طورکلی میزان عملکرد گندم در کشور ما نسبت به متوسط جهانی در سطح پایین تری قرار دارد و در طی سال های اخیر (2008 تا 2011) در حال نوسان بوده است (شکل2-1). رسیدن به این سطح و افزایش آن، نیازمند مدیریت و برنامه ریزی دقیق جهت بهره برداری مناسب از ژرم پلاسم موجود است. مهم ترین بخش این مدیریت، تولید ارقامی با پتانسیل بالا از لحاظ عملکرد دانه، عملکرد پروتئین و سازگار با شرایط مختلف محیطی است و اولین گام در هر برنامه اصلاحی، ارزیابی صفات کمی و کیفی و تعیین سطح تنوع ژنتیکی ژرم پلاسم موجود می باشد تا با تلاقی های مناسب و اعمال روش های گزینشی مطلوب دستیابی به اهداف مورد نظر حاصل گردد. شکل 2-1- مقایسه عملکرد گندم ایران و جهان در طی سال های 1995 تا 2012 (فائو، 2012) 2-2- دانه گندم دانه گندم، گندمه (کاریوپس ) می باشد و پوست دانه آن را احاطه نموده است (حیدری شریف آباد، 1379). دانه گندم به شکل های بیضی، گرد، تخم مرغی و بیضی دراز می باشد، قسمت پشت دانه گندم بدون شیار و مدور و قسمت شکم شیاردار می باشد. شیار شکمی در تمام طول دانه امتداد دارد. طول دانه بین 4 تا 12 میلی متر و ضخامت آن بین 5/1 تا 4 میلی متر متغیر است که حدود 5/3 درصد آن را جنین، 9 تا 10 درصد آن را پوسته، 85 تا 86 درصد آن را آندوسپرم و 3 تا 4 درصد آن را لایه آلورون تشکیل می دهد (راشد محصل و همکاران، 1376). آندوسپرم بزرگترین بخش دانه می باشد که عمدتاً شامل پروتئین و نشاسته است. در انتهای دانه گندم کرک های ضعیفی وجود دارد، رنگ دانه ها سفید متمایل به خاکستری، زرد، قرمز روشن و قرمز تیره می باشد و وزن هزاردانه گندم بین 15 تا 60 گرم متغیر است (نورمحمدی و همکاران، 1386). نشاسته در آندوسپرم در دو حالت گرانولی ذخیره می شود: گرانول های بزرگ a و گرانول های کوچک b. آندوسپرم همچنین حاوی یک ماتریکس پروتئین ذخیره ای ساخته شده از اجسام پروتئینی است که با واکوئل ها در سلول های آندوسپرمی در طی مراحل نمو ادغام می شوند. هنگامی که بذر نمو یافته و بلوغ پیدا می کند، رسوب مداوم ذخایر آندوسپرمی به دنبال از دست دادن آب، باعث خسارت غشای اجسام پروتئینی اصلی شده و یک تلغیظ پروتئین در ماتریکس زمینه ای اطراف دانه های نشاسته در آندوسپرم بالغ صورت می گیرد (ایوانز، 1999). هرچند گندم مصارف بسیاری دارد، ریشه ی اصلی عامه پسندی آن به دلیل ظرفیتش برای تولید نان است. در مراحل فرآوری، محتویات گندم در کیفیت آرد تولیدی بسیار مهم هستند. پس ساختمان و ترکیب دانه گندم در تولید یک نان خوب بسیار موثر است. گاهی به اشتباه می گوییم بذر، اما در واقع دانه گندم یک میوه است و بذر توسط پریکارپ میوه پوشانده شده است. بذر از یک جنین، حاوی اسکوتلوم و یک محور جنینی تشکیل شده است. طبق گفته میلر (1998) گیاهچه به تمام قسمت های جنین گفته می شود. پریکارپ از دیواره ی تخمدان مشتق می شود و همراه با پوشش بذر و لایه آلئورن قسمتی را تشکیل می دهد که میلر به آن پوسته گندم یا سبوس می گوید. پریکارپ از سلول هایی تشکیل شده که سیتوپلاسم خود را از دست می دهند و هنگامی که دانه ها بالغ می شوند، پریکارپ یک دیواره لیگنینی به دست می آورد. قسمتی که به پریکارپ متصل شده و بذر را احاطه کرده در واقع پوشش بذر یا تستا می باشد، که یک لایه ی سلولی است که از پوشش های تخمک مشتق می شود. از دیگر ترکیبات پوست گندم لایه آلئورن است که تنها یک سلول ضخامت دارد. مهم ترین موادی که در ترکیبات شیمیایی دانه گندم وجود دارد، در جدول 1-1 ذکر شده اند. جدول 2-1- اجزای سازنده دانه گندم (کاظمی اربط، 1387) درصد تقریبی اجزای سازنده 8 تا 18 رطوبت 8 تا 18 پروتئین 1 تا 2 خاکستر (مواد معدنی) 8 تا 25 مواد ازته 5/1 تا 2 چربی 57 تا 72 نشاسته و قند 1 تا 2 سلولز 2-3- ترکیب بیوشیمیایی آندوسپرم گندم آرد گندم که از آسیاب آندوسپرم ساخته می شود، حاوی 70 تا 80 درصد نشاسته، 10تا 15 درصد پروتئین و 1 تا 2 درصد لیپید است. نشاسته در گرانول ها ابتدا از دو پلی ساکارید آمیلوز و آمیلوپکتین تشکیل شده است. جزء پروتئینی آندوسپرم از پروتئین ذخیره ای تشکیل شده که در طول دوره رشد گیاهچه، جنین را با نیتروژن حمایت می کند. همچنین پروتئین هایی در دانه های نشاسته ای وجود دارند که از پروتئین های ذخیره ای متمایز هستند. این پروتئین های گرانولی دو نوعند: پروتئین هایی که در سطح گرانول های نشاسته اند و به راحتی با نمک یا سدیم دودسیل سولفات (sds) در دمای اتاق از بین می روند و پروتئین های اینتگرال که از بین رفتن آن ها سخت تر است. پروتئین های سطحی گرانول های نشاسته ای می توانند توسط آنالیز الکتروفوز ژل پلی اکریل آمید (sds-page) به صورت دو باند اصلی 15 و 30 کیلو دالتون تشخیص داده شوند. باند 15 kda، فری ابیلین نامیده شده و به عنوان یک پروتئین نشانگر برای نرمی دانه ها مورد توجه است. این پروتئین ها در یک غلظت بسیار بالا در گندم های نرم مشاهده می شوند، اما در گندم های سخت در مقادیر بسیار کم و در گندم دوروم به طورکلی وجود ندارند (هاسنی، 1994). 2-4- بذرها به عنوان منابع پروتئین ها بذرها اندام های اصلی گیاهی اند که توسط بشر برداشت می شوند. متعاقباً آن ها منابع اصلی پروتئین در تغذیه انسان و دام می باشند. در واقع، هر ساله حدود 350 میلیون تن پروتئین به تنهایی از بذر گیاهان زراعی مهم تأمین می شود در حالی که این مقدار، بذر گیاهان زراعی دیگر و بذرهای به دست آمده از گیاهان وحشی را شامل نمی شود. مقدار پروتئین بذرها به طور قابل توجهی متغیر است. در مقایسه با بسیاری از محصولات دیگر، کم ترین مقدار ثبت شده در غلات (میانگین در حدود 12 درصد وزن خشک) وجود دارد. با این حال، پروتئین غلات در حدود 70 درصد کل پروتئین برداشت شده را به-خود اختصاص می دهد، که به خاطر بالا بودن تولید کل آن هاست (سالونکه و همکاران، 1992). عوامل تعیین کننده ی میزان پروتئین بذر هنوز به طور دقیق شناخته نشده اند، اما علاقه شدیدی در زمینه دستورزی ترکیب بذر وجود دارد، به عنوان مثال گندم به طور معمول بیشترین موفقیت را در بین محصولات دنیا از نظر سطح زیرکشت و عملکرد داراست، اما تنها در حدود 10 تا 15 درصد پروتئین دارد. بنابراین تنها 20 درصد کل پروتئین تولیدی محصولات اصلی لیست شده را به خود اختصاص داده است. پروتئین گلوتن گندم خاصیتی منحصر به فرد دارد و می تواند خیلی سریع در مقیاس صنعتی از نشاسته آن جدا شود. افزایش مقدار پروتئین گندم به وضوح تأثیری عمده بر بهره برداری از منابع پروتئینی مختلف می گذارد، به جز استفاده از کود اضافی، سایر روش های دستیابی بیشتر به آن درستی شناخته نشده است (فائو، 2008). 2-5- پروتئین های ذخیره ا ی پروتئین های ذخیره ای به عنوان پروتئین هایی شناخته می شوند که معمولاً به تنهایی نقش بیولوژیکی در فراهم کردن ذخیره کربن، نیتروژن و سولفور جهت انتقال و مصرف برای حمایت از رشد گیاهچه ایفا می کنند. این پروتئین ها در حدود نیمی از پروتئین های بذر را در غلات کم پروتئین و نسبت بیشتری را در گونه های غنی از پروتئین نظیر سویا، به خود اختصاص می دهند. هرچند سنتز آن ها در همه گونه ها تحت تأثیر کنترل غذایی صورت می گیرد و زمانی که مقادیر زیاد نیتروژن و مقدار نسبتاً کمتری سولفور در دسترس باشد، سنتز در مقادیر بالاتری صورت می گیرد. این به کشاورز اجازه می دهد تا بذر با پروتئین بهینه ای جهت کاربرد نهایی تولید کند، برای مثال، در انگلستان در فرآوری بذر به مقدار پروتئین حدود 14-11 درصد، جهت تولید نان گندم نیاز دارند ولی برای مالت سازی جو، به مقدار کمتر (تقریباً 8 درصد) نیاز است (توکل افشاری و همکاران، 1387). 2-6- کیفیت در گندم (پروتئین های بذر گندم، دلیل خصوصیات استثنایی این گیاه) کیفیت گندم در درجه اول تابع کیفیت و کمیت پروتئین آن است. کیفیت یک محصول عبارت است از مجموعه خصوصیات مطلوب برای هر محصول زراعی که بسته به نوع مصرف آن متفاوت است. برای مثال کیفیت یک رقم با آندوسپرم نرم به صورت مناسب بودن آن برای آرد کردن و تولید کیک و کلوچه تعریف می گردد و کیفیت یک گندم دوروم به صورت مناسب بودن برای تولید سمولینا و ماکارونی تعریف می شود. کیفیت گندم های سخت بهاره و زمستانه عبارت است از خواص ویژه آن ها که تعیین کننده مطلوبیت آن ها برای آرد کردن است (توکل افشاری و همکاران، 1387). در بین عوامل مختلف، پروتئین های ذخیره ای بذر از مهم ترین عوامل موثر در ایجاد تفاوت در کیفیت ارقام گندم محسوب می گردند. این پروتئین ها نقش اصلی را درایجاد خواص رئولوژیک (خواص فیزیکی یا شکل پذیری و جریان مواد مانند قابلیت کشش خمیر و الاستیسه که بر روی قابلیت نگهداری گاز توسط خمیر اثر داشته) و کیفیت آرد و پخت نان دارند. در واقع پروتئین های ذخیره ای بذر مسئول خواص منحصر به فرد چسبندگی و قابلیت ارتجاع در خمیر آرد گندم هستند (برنالد و همکاران، 2001). کیفیت آرد و پخت نان در یک رقم گندم صفتی پیچیده و تحت تأثیر عوامل متعدد محیطی و ژنتیکی است. تعادل بین ترکیبات مختلف مانند نشاسته، پروتئین های گلوتن، لیپیدها، آب و تداخل بین این ترکیبات تعیین کننده کیفیت یک رقم هستند (بحرائی،1382). بدیهی است که ژن های کاملاً شناخته شده ای که تنوع آللی آن ها بر روی محصول نهایی گندم تأثیر می گذارند، شامل ژن های کنترل کننده زیرواحدهای گلوتنین سنگین (glu-1)، گلوتنین سبک (glu-3)، گلیادین ها، کمیت پروتئین ها، سختی دانه، نشاسته ( شامل پروتئین های مومی و محتوای آمیلوز و آمیلوپکتین و سایر ژن های بیوسنتز نشاسته)، لیپیدها و لیپوپروتئین ها، رنگ بذر و آنزیم های آلفا و بتاآمیلاز هستند (بحرائی،1382). 2-7- عوامل موثر در کیفیت و ارزش نانوایی گندم پروتئین گندم به ویژه پروتئین آندوسپرم و سبوس آن از نظر تغذیه ای دارای ارزش بالایی است. از نظر تکنولوژی پخت، ویژگی های فیزیکی پروتئین ها اهمیت دارند که مربوط به گلوتن آن می باشد. کیفیت گلوتن گندم تابع عوامل مربوط به گونه آن است. بیشتر پروتئین آندوسپرم از نوع گلوتن است و پروتئین پوسته از گلوبولین، آلبومین و پرولامین است که طی عمل آسیاب کردن بخشی از این پروتئین ها حذف می شوند (ایران نژاد و شهبازیان، 2005). 2-7-1- وزن هزاردانه وزن دانه برحسب وزن هزاردانه بیان می شود و تابعی است از اندازه و دانسیته دانه، هرچه دانه ها بزرگ تر و دارای دانسیته بیشتری باشند مقدار آندوسپرم آن ها در مقایسه با سایر قسمت ها بیشتر است و برعکس هر قدر دانه ها کوچک تر و دارای دانسیته کمتر باشند آندوسپرم آن ها هم کمتر است. ممکن است این تصور پیش آید که وزن هزاردانه در مقایسه با وزن واحد حجم گندم معیار بهتری از بازدهی محصول است، لیکن در عمل این طور نیست، وزن هزاردانه در گونه های مختلف و شرایط کاشت محصول متفاوت است. برای نمونه وزن هزاردانه در گندم سخت قرمز زمستانه و بهاره حدود 20 تا 22 گرم (پروتئین بیشتر) و در گندم نرم قرمز زمستانه و گندم سفید حدود 30 تا 34 گرم است (نیکوسرشت، 1382) . 2-7-2- وزن حجمی یا وزن واحد حجم وزن واحد حجم گندم یکی از معیارها و عوامل مهم و موثر در کیفیت و ارزیابی این محصول است که بیشتر بر حسب کیلوگرم به ازای هکتولیتر بیان می شود، در آمریکا، کانادا و انگلیس واحد آن پوند بر بوشل است. در این عامل اندازه دانه تأثیر زیادی ندارد و برعکس یکنواختی شکل دانه همچنین دانسیته (که خود مربوط به عوامل بیولوژیکی و ترکیب شیمیایی دانه است) در آن تأثیر زیادی دارند. از روی وزن واحد حجم می توان میزان بازدهی آرد آن را تخمین زد، به علاوه برای درجه بندی گندم از این فاکتور هم استفاده می گردد (نیکوسرشت، 1382). 2-7-3- اندازه و شکل دانه بدیهی است که اندازه دانه ارتباط نزدیکی با وزن آن دارد و عاملی است که برای تخمین بازدهی تولید به کار می رود، برای تعیین اندازه دانه گندم از مقطع دادن دانه استفاده می شود، به علاوه از الک-های سیمی مختلفی برای تعیین اندازه های مختلف دانه ها و به ویژه تعیین درصد اندازه های نمونه بهتر استفاده می شود (ارزانی، 2002). 2-7-4- سختی دانه آرد مناسب برای تولید نان بیشتر از گندم سخت تهیه می شود زیرا دارای مقدار پروتئین بیشتری است و گلوتن آن مرغوب تر است، از طرفی سختی دانه خود یکی از عوامل موثر در کیفیت است، گندم سخت آردی به دست می دهد که دارای حالت زبر و دانه ای می باشد که برای نان مطلوب است (ارزانی، 2002). 2-7-5- رنگ عموماً گندم های قرمز رنگ از کیفیت بالاتری نسبت به گندم های سفید برخوردار می باشند. در طبقه بندی گندم از نظر رنگ پوسته، آن را به دو دسته سفید و قرمز تقسیم می نمایند که به عوامل ژنتیکی هر رقم بستگی دارد و هر یک از این رنگ ها خود دارای رنگ های دیگری هم هستند. به طور کلی رنگ های سفید و قرمز مربوط به گونه و جنس گندم می باشند درحالی که رنگ های دیگر مربوط به هر یک از این دو دسته اصلی ممکن است مربوط به عوامل محیطی باشد (نیکوسرشت، 1382). 2-7-6- مواد خارجی تمام مواد موجود در محصول به غیر از دانه های سالم، یکدست و یکنواخت را ناخالصی ها می گویند و شامل: دانه های شکسته گندم و هر غله دیگر، دانه های چروکیده و ضعیف، دانه های سایر واریته ها، دانه های جوانه زده، دانه های آفت زده، بذر علوفه، دانه های کپک زده و سیاهک زده، دانه های سرما زده، ذرات شن و هر غله دیگر که خارج از حد استاندارد است، می باشد. هر چه مواد خارجی در گندم کمتر باشد،گندم بهتر است و درجه یک نامیده می شود. ناخالصی های گندم از هر نوع و مقدار که باشند دارای اهمیت می باشند و بنابراین استانداردهای مختلفی هم برای آن ها وجود دارد، خوشبختانه بیشتر این مواد در طی تمیز کردن و آماده کردن محصول جهت آسیاب کردن حذف می شوند اما وجود آن ها در ماده اولیه مبین کیفیت پایین روش برداشت و نگهداری محصول بوده و می تواند اختلالات احتمالی حاصل شده در دانه را بیان نماید (خدابنده، 1371 ؛ نیکوسرشت، 1382). 2-7-7- دانه های آسیب دیده دانه گندم حتی پیش از برداشت در مزرعه در اثر عوامل گوناگون مانند آفات و بیماری های مختلف، سبز شدن و غیره ممکن است آسیب ببیند، درطی درو کردن و خشک کردن و همچنین در طی جا به جایی و انبار کردن محصول این آٍسیب ها زیادتر می شوند، آسیب های دانه در کیفیت محصول نهایی از نظر فرآیندهای مختلف و قابلیت نگهداری تأثیر نامطلوب دارند و لازم است از بروز آن ها جلوگیری شود (نیکوسرشت، 1382 ؛ حق پرست و همکاران، 1388). دانه گندم پیش از برداشت در شرایط آب و هوای مرطوب و یا بارندگی های موسمی و غیر قابل پیش بینی، ممکن است روی پایه جوانه زده و بدین جهت بازدهی مقدار آرد حاصل از آن کاهش یافته و برعکس مقدار آنزیم آلفا آمیلاز افزایش یافته و موجب چسبندگی خمیر شود، همچنین مقدار جذب آب آرد حاصل کم شده و در نتیجه بازدهی محصول حاصل از آرد هم کاهش می یابد، در مواردی که گندم از مناطقی که دارای آب و هوای خشک هستند به دست آمده باشد مقدار آنزیم آلفاآمیلاز آرد کم است و برای جبران آن باید از موادی نظیر عصاره مالت، آرد مالت و یا فرآورده های آنزیمی استفاده نمود. بدیهی است آرد به دست آمده از این راه برای تولید نان مناسب است، اگر مقدار آلفاآمیلاز از حد معینی تجاوز کند در تخمیر اختلالاتی حاصل می گردد که نامطلوب است (ارزانی، 2002). خشکی هوا و یا کم شدن آبیاری پیش از رسیدن محصول نیز موجب لاغر شدن دانه و تضعیف ویژگی های صنعتی آرد آن می شوند، از این ها گذشته افزایش دما و رطوبت محصول در انبار و آفات انباری هم درکیفیت محصول موثرند و بنابراین برای فرآورده های مختلف استانداردهایی برای دانه های آسیب دیده وجود دارد که عملاً مقدار آن را محدود می کند (نیکوسرشت، 1382 ؛ سمیعی، 2004). 2-7-8- رطوبت مقدار رطوبت موجود در گندم یکی از مهم ترین عوامل موثر در کیفیت آن است، زیرا مقدار مواد خشک دانه بستگی به مقدار رطوبت دارد، در نقاط مرطوب رطوبت گندم حدود 14 درصد و در نقاط خشک حدود 8 درصد است. بدیهی است در حالتی که رطوبت گندم 14 درصد باشد مقدار بیشتری آب مورد معامله قرار می گیرد و اگر مقدار رطوبت کمتر باشد زمان قابلیت نگهداری محصول افزایش یافته و گندم خشک برای سال ها قابل نگهداری است، درحالی که گندم مرطوب ممکن است ظرف مدت چند روز فاسد شود و اگر گندم خیلی خشک باشد، برخی از ویژگی های کیفی آن تحت تأثیر قرار می گیرد و به ویژه حالت شکننده داشته و در طی جا به جایی دانه ها شکسته می شوند و این کیفیت در مورد گندم هایی که از پیش مرطوب بوده و به طور مصنوعی خشک شده اند شدیدتر است. دانه های خرد شده به ویژه از نظر این که در طی عملیات آماده کردن نمونه برای آسیاب کردن حذف می شوند از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نیست و آرد حاصل کیفیت پایین تری دارد (نیکوسرشت، 1382 ؛ ارزانی، 2002). 2-7-9- مقدار پروتئین مقدار کل پروتئین گندم متفاوت است که مربوط به عوامل نژادی و محیطی است. آبیاری یا بارندگی زیاد در طی زمان رسیدن دانه موجب کاهش مقدار پروتئین می شود و برعکس، از طرفی مقدار پروتئین بستگی به مقدار ازت خاک دارد، کودهای ازته نظیر اوره در مواقع مناسب به ویژه در موقع رسیدن دانه موجب افزایش پروتئین می شوند. کیفیت آرد و نان بستگی به مقدار پروتئین دارد که هرچه پروتئین بیشتر باشد کیفیت افزایش می یابد (نیکوسرشت، 1382 ؛ ایران نژاد و شهبازیان، 2005). برای استخراج پروتئین می توان از کل دانه گندم یا نصف آن استفاده کرد و به روش تاتهام و همکاران (2008) مرحله به مرحله استخراج پروتئین انجام می گیرد: 1- بذر در آسیاب های برقی کوچک (آسیاب سایشی) آرد گردیده و در میکروتیوپ های 5/1 میلی لیتری ریخته می شود و 200 میلی گرم از آرد را در یک میلی لیتر 1-پروپانول 50 درصد حل کرده و نمونه به مدت یک ساعت در دمای 20 درجه سانتی گراد نگهداری شود. سپس در دور 5000 گراد به مدت 10 دقیقه در دمای 20 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردد. بخش بالایی را دور ریخته و بخش پایینی را نگه می داریم. 2- به بخش پایینی یک میلی لیتر nacl 5/0 مولار اضافه نموده و به خوبی مخلوط گردد و برای یک ساعت در دمای 20 درجه سانتی گراد با استفاده از روتر به هم زده شود. 3- نمونه را در 5000 گراد به مدت 10 دقیقه در دمای 20 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شود و بخش بالایی حذف شده و به بخش پایینی یک میلی لیتر آب مقطر اضافه شده و 10 دقیقه به هم زده شود. 4- به بخش پایینی یک میلی لیتر اتانول 70 درصد اضافه شده و به خوبی مخلوط شده و به مدت یک ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شود. سپس در 5000 گراد به مدت 10 دقیقه در دمای 20 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و بخش بالایی حذف گردد (الکل باعث حذف گلیادین ها می شود). 5- بخش پایینی را مجدداً در یک میلی لیتر محلول حاوی 50 درصد 1-پروپانول + 2 درصد 2-مرکاپتواتانول + یک درصد اسید استیک به مدت یک ساعت در دمای 20 درجه سانتی گراد مخلوط گردد. توجه: از این محلول به اندازه کافی برای نمونه ها درست شود. 6- نمونه ها در 5000 گراد به مدت 10 دقیقه در 20 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و بخش پایینی را دور ریخته و بخش بالایی حفظ می شود. این بخش حاوی زیرواحدهای گلوتنین غیر محلول در الکل خواهد بود. 7- از نمونه باقیمانده قسمت بالا، 500 میکرولیتر را در تیوب جدید ریخته و 200 میکرولیتر استون را به آن اضافه کرده و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 20 درجه سانتی-گراد نگهداری شود و در ادامه نمونه ها با دور بالا (12000 گراد) به مدت 10 دقیقه در دمای 20 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند و بخش پایینی حاوی گلوتنین ها خواهد بود. 8- 500 میکرولیتر از بافر نمونه (رقیق شده) را به گلوتنین های محلول نمونه اضافه و 10 تا 20 میکرولیتر از آن برای بارگیری در چاهک ها استفاده شود (در این تحقیق 10 میکرولیتر استفاده شد). برای رقیق کردن بافر استخراج x3 براساس جدول 3-2 عمل می شود: جدول 3-2- محلول های مورد نیاز (بافر نمونه) در استخراج پروتئین بر حسب میلی لیتر مقدار بافر مورد نیاز آب مقطر بافر استخراج x3 2- مرکاپتواتانل 6 4 7/1 3/0 9 6 55/2 45/0 12 8 4/3 6/0 18 12 1/5 9/0 24 16 8/6 2/1 ترکیب 2- مرکاپتواتانل باعث شکستن پیوند های دی سولفیدی بین زنجیر های پروتئین می گردد و آن ها را از هم جدا می کند.