طراحی و ساخت یک آنتاگونیست از vegf به منظور مهار آنژیوژنز

آنژیوژنز در بسیاری از شرایط پاتولوژیک همچون رشد تومور، متاستاز، رتینوپاتی دیابتی، روماتوئید آرتریت و پسوریازیس نقشی کلیدی ایفا می کند. از میان تمامی فاکتورهای آنژیوژنیک، فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf) مهمترین فاکتور آنژیوژنز محسوب می شود و فعالیت آن از طریق اتصال به دو گیرنده تیروزین کینازی به نام های گیرنده flt-1 (vegfr-1) و گیرنده kdr (vegfr-2) انجام می شود. هومودایمر vegf از طریق اتصال به vegfr-2 و القاء دایمریزاسیون آن باعث اتوفسفریلاسیون و فعال سازی مسیرهای انتقال سیگنال آنژیوزنز می شود. vegf به دلیل نقش اساسی اش در آنژیوژنز پاتولوژیک، به عنوان یک هدف دارویی ارزشمند برای درمان های ضدآنژیوژنز مطرح می باشد. یک واریانت هترودایمر از vegf (hd-vegf) که جایگاه اتصال به گیرنده آن در یک قطب دایمر دست نخورده و در قطب دیگر بلاک شده باشد تنها قادر خواهد بود به مونومر گیرنده متصل شود و در نتیجه قادر به القاء دایمریزاسیون گیرنده و انتقال سیگنال نخواهد بود. بنابراین hd-vegf می تواند به عنوان آنتاگونیست vegf عمل کرده و فعالیت وابسته به گیرنده vegf، که برای فرایندهای آنژیوژنز ضروری می باشد را متوقف نماید. با چنین فرضی، در این تحقیق جایگاه های اتصال vegf به kdr براساس ساختار کریستالی کمپلکس vegf-kdr بطور دقیق مشخص و با قطعات مناسب از سایر پروتئین ها در ساختار کریستالی مربوطه جایگزین شدند. پس از ساخت مدل سه بعدی جهش یافته و بهینه سازی آن توسط شبیه سازی دینامیک ملکولی، اتصال آن به گیرنده با استفاده از docking molecular مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بیانگر نامناسب بودن انرژی میانکنش این کمپلکس پروتئینی و در نتیجه عدم اتصال vegf موتانت به گیرنده می باشد. براساس مدل ساخته شده، ژن کد کننده دمین اتصال به گیرنده vegf که حاوی قطعات جایگزین فوق بود سنتز شد. قطعه کد کننده دمین اتصال به گیرنده vegf طبیعی در pet-28a+ دارای his tag و قطعه کد کننده دمین اتصال به گیرنده ژن vegf جهش یافته در وکتور بیانی pet-21a+ دارای strep tag درج و در باکتری e. coliبه صورت inclusion bodies بیان و پس از مخلوط نمودن رسوب با نسبت های برابر جهت تولید واریانت هترودایمر vegf، طی فرایند چند مرحله ای refold گردیدند. بدلیل وجود دو tag متفاوت، جداسازی هترودایمر vegf از همودایمرهای طبیعی و جهش یافته با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی دو مرحله ای و توسط ستون هایni-nta agarose و strep-tactin صورت پذیرفت. دایمر شدن واریانت های مختلف vegf که لازمه فعالیت این پروتئین می باشد از طریق sds-page و روش المان تایید گردید. مطالعات اسپکتروسکپی cd و فلورسانس تغییرات ساختاری محسوسی را در hd-vegf در مقایسه با هومودایمر طبیعی و جهش یافته نشان نداد ونیز شکل گیری صحیح فرم هترودایمر و همچنین صحت فرایند تخلیص را تائید نمود. توان ضدآنژیوژنز واریانت hd-vegf نیز بررسی گردید. نتایج نشان داد که این واریانت در غلظت های پائین به طور قابل توجهی قادر به مهار تکثیر و تشکیل لوله های مویرگی سلول های اندوتلیال می باشد (با ng/ml 24 و 33 ic50= به ترتیب برای تکثیر سلول-های اندوتلیال و تشکیل لوله های مویرگی). براساس این مطالعات می توان نتیجه گرفت که hd-vegf در اتصال به گیرنده با vegf طبیعی قادر به رقابت بوده و مانع از فعالیت آن در شرایط in vitro می گردد. ضمنا این واریانت در مقایسه با سایر آنتاگونیست های ضدآنژیوژنزvegf که تاکنون ساخته شده اند قدرت مهاری بسیار بالاتری دارد.