اصلاح انتقال ژن توسط سامانه کیتوزان با استفاده از رتینوئیک اسید و پکتین به سلول hepg2

در این رساله اصلاح انتقال ژن توسط سامانه کیتوزان با استفاده از رتینوئیک اسید و پکتین به سلول hepg2 بررسی شد. ابتدا، تراگاکانتیک اسید –نوعی پکتین شاخه دار- از صمغ کتیرا جدا شد. وزن ملکولی به روش کروماتوگرافی نفوذ ژلی و ویسکوزیته ذاتی تعین و درصد استریفیکاسیون به روش تیتراسیون محاسبه شد. سمیت سلولی این پلیمر روی رده های سلولی hela، hepg2 و l929 بررسی و چسبندگی سلولی روی رده سلولی l929 مطالعه شد. با روش ژلاسیون یونی و در نسبت های مختلف وزنی، نانوذرات کیتوزان-تراگاکانتیک اسید ساخته شد. به روش کونژوگاسیون تراکمی کیتوزان- رتینوئیک اسید در نسبت های مولی متفاوت از رتینوئیک اسید تهیه و صحت انجام واکنش توسط طیف بینی ftir و nmr ارزیابی و از مشتقات حاصله به روش اولتراسونیک میسل ساخته شد. پکتین به روش ژلاسیون یونی و در نسیت های وزنی متفاوت روی پلی پلکس پوشش داده شد. مورفولوژی نانوذرات با sem و اندازه ذره ای ، بار سطحی و تاثیر ph بر بار سطحی و اندازه ذره ای با روش تفرق نور لیزر اندازه گیری شد. در نهایت سمیت سلولی نانوذرات و نانومیسل روی دو رده سلولی hela و hepg2 و پلی پلکس پوشش داده شده با پکتین روی cos7 به روش mtt ارزیابی شد و غلظت بحرانی میسل با استفاده از پیرین و به روش فلوئورسنس بررسی شد. امکان بارگذاری رتینوئیک اسید در سامانه ارزیابی و درصد بارگذاری، مقدار بارگذاری و سرعت رهایش با استفاده از طیف بینی uv بررسی شد. پلاسمید به روش برهمکنش یونی روی نانوذرات و در پلی پلکس کیتوزان بارگذاری شد. نسبت باری بهینه حامل به پلاسمید از طریق روش ژل الکتروفورز یا فلئومتری تعیین و سپس در چندین نسبت باری بالاتر از نسبت بهینه، ترانسفکسیون روی رده های hela، hepg2 و cos7 ارزیابی شد. وزن ملکولی تراگاکانتیک 300 کیلودالتون و درصد استریفیکاسیون 94% محاسبه شد. پلیمر فاقد سمیت سلولی بود و نسبت به آلژینات چسبندگی سلولی بهتری داشت. نانوذرات کیتوزان/تراگاکانتیک با نسبت وزنی 3 و اندازه ذره ای 77/6±5/132 نانومتر و بارسطحی 84/1±45/30 میلی ولت جهت مطالعات بیان ژن انتخاب شد. بررسی کونژوگه کیتوزان-رتینوئیک اسید نشانگر انجام واکنش بود و غلظت بحرانی میسل ها بین 2-10×3/1 تا 2-10×13/2 میلی گرم بر میلی لیتر بود. اندازه ذره ای میسل ها در محدوده 4/208-14/142 نانومتر و بارسطحی بین 25/27+ تا 48/34+ بود و نانومیسل ها شکل کروی داشتند. نتایج ژل الکتروفورز نشانگر بارگیری کامل پلاسمید توسط نانوپلکس در نسبت های باری بالاتری نسبت به پلی پلکس کیتوزان بود. ترانسفکسیون نانوپلکس نسبت به پلی پلکس کیتوزان بالاتر بوده، افزایش ترانسفکسیون در رده سلولی hepg2 بیشتر از رده سلولی hela بود که احتمالا به وجود گالاکتوز در ساختار تراگاکانتیک اسید و رسپتورهای آسیالوگلایکوپروتئین مرتبط است. بیان ژن مسی پلکس در سلول های hela و hepg2 نسبت به پلی پلکس و نانوپلکس کمتر بود ولی به علت پایداری بالای سامانه در حضور 10% سرم، ترانسفکسیون افزایش یافت. میزان بارگیری پلاسمید در این سامانه نسبت به دیگر سامانه ها بالاتر بود و پلاسمید در نسبت باری بالاتر از 5/0 بطور کامل در میسی پلکس بارگیری شد. اثر پوشش پکتین بر سمیت سلولی پلی پلکس پلی اتیلن ایمین و پایداری سامانه در برابر هپارین نشانگر کاهش سمیت سلولی این حامل در رده سلولی و افزایش پایداری سامانه پوشش داده شده بود درحالی که ترانسفکسیون سامانه پوشش دار نسبت به سامانه فاقد پوشش، کاهش چندانی نداشت. کلمات کلیدی: کیتوزان، رتینوئیک اسید، پکتین، تراگاکانتیک اسید، انتقال ژن، سمیت سلولی