ارزیابی مقایسه ای روند تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی در حالت طبیعی و مدیفای شده پروتئین های بتالاکتوگلوبولین و آلفاکیموتریپسین گاوی

اشتباه تاخوردن برخی از پروتئین ها که اغلب همراه با تجمعات پروتئینی می باشد، عموما فیبریل های آمیلوئیدی نامیده می شود. تشکیل فیبریل ها یک رویداد پاتوژنیک در بیماری آلزایمر است. از این رو، مهار تشکیل فیبریل یک روش درمانی محسوب می گردد. طراحی منطقی مهارکننده های تشکیل فیبریل نیازمند روشن سازی مراحل و سینتیک تشکیل فیبریل می باشد. با وجود تلاش های زیادی که در زمینه شناخت چگونگی تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی صورت گرفته، آگاهی درباره نیروی های پیش برنده و نیز مکانیسم این تجمعات پروتئینی وجود ندارد. در مطالعه حاضر، روش های مختلف از قبیل کدورت سنجی، کالریمتری و تغییر شیمیایی برای آشکار ساختن رویدادهای تشکیل آمیلوئید در پروتئین طبیعی و تغییر یافته بتالاکتوگلوبولین مورد استفاده قرار گرفته است. ابتدا پروتئین بتالاکتوگلوبولین (?-lg) با استفاده از رسوب دهی پلی اتیلن گلایکول خالص گردید. سپس، برای تهیه کردن پروتئین مدیفای،اسیدآمینه های لایزین در دسترس با سیتراکونیک انیدرید واکنش داده شد. برای بررسی سینتیکی تبدیل پروتئین طبیعی و مدیفای ?-lg به فیبریل های آمیلوئیدی، غلظت های مختلف پروتئین در بافر فسفات 50 میلی مولار در phهای 2 یا 4 در دمای 80 درجه سانتی گراد تیمار شدند و بی درنگ تغییرات کدورت در 400 نانومتر پی گیری شد. به علاوه، غیرطبیعی شدن گرمایی پروتئین طبیعی/مدیفای ?-lg به وسیله کالریمتری مطالعه گردید. آنالیز سینتیکی تجمع پروتئین طبیعی بتالاکتوگلوبولین نشان داد که کدورت در 400 نانومتر به تدریج افزایش می یابد، در حالی که پروتئین مدیفای تمایل بیشتری را برای تجمع نشان داد. تغییر آنتالپی ظاهری کالریمتری و tm دو پروتئین طبیعی و تغییریافته نشان داد که پایداری پروتئین مدیفای در مقایسه با پروتئین طبیعی کاهش پیدا کرده است. tango، aggrescan و آنالیزهای تئوری پیشنهاد کرد برخی از باقی مانده های لایزین نقش اساسی در فرآیند تجمع دارند. در مطالعه جداگانه ای، استیلاسیون لایزین در جهت خنثی نمودن بار الکتریکی باقی مانده های اسیدآمینه در دسترس آلفاکیموتریپسین به کار گرفته شد و از تکنیک های مختلفی از جمله کدورت سنجی و آنالیز ترمودینامیکی به خوبی برای مقایسه رفتار پروتئین در حالت طبیعی و مدیفای بکار گرفته شد. تجزیه و تحلیل های سنیتیکی آشکار می سازد که پروتئین طبیعی تمایل به تجمع دارد در حالی که در مقایسه پروتئین مدیفای کاهش تمایل به تجمع را نشان می دهد. با توجه به وجود گزارش های بحث برانگیز در مورد رابطه بین پایداری پروتئین و تمایل پروتئین برای تجمع آمیلوئیدی، اطلاعات بدست آمده از این مطالعه پیشنهاد می کند که توانایی تجمع در هر پروتئینی ممکن است اصولا در نتیجه کاهش پایداری ترمودینامیکی آن باشد. علاوه بر این، تیوقلاوین تی (tht) یکی از مولکول های است که برای تشخیص رسوب های آمیلوئیدی در نظر گرفته شده است، چربی دوستی آن برای عبور از سد خونی مغزی بسیار پایین است، انگیزه های قوی وجود دارد تا ترکیبات مناسبی برای تشخیص فیبریل ها در شرایط in vitro توسعه پیدا کند. از این رو، در این مطالعه ما با سنتز مشتقات بنزوتیازول و بنزوفورانون به عنوان نشانگر (پروب) های فلوئورسنت از هر دوی آن ها برای تشخیص کمی فیبریل آمیلوئیدی تولید شده از کیموتریپسین مورد استفاده قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل مطالعات در in vitro نشان داد که ترکیبات 2 و 4 به خوبی به ساختارهای آمیلوئیدی متصل می شود در حالی که ترکیبات 1 و 3 تمایل پایین تری در اتصال به فیبریل ها را نشان می دهد.