بررسی اثر حذف مارپیچ ?3 بر فعالیت لیپاز geobacillus thermocatenulatus (btl2) با روش مهندسی پروتئین

لیپازها خصوصاً لیپازهای با منشأ میکروبی، گسترده ترین گروه آنزیم هایی هستند که کاربردهای زیست -فناوری و شیمی آلی همچون کاربرد در صنایع غذایی، شوینده ها، صنایع دارویی، کشاورزی و... دارند. لیپازهای باکتریایی عضو خانواده ?/? هیدرولازها هستند که هیدرولیز و سنتز اسیل گلیسرول ها در حدفاصل آب-چربی را کاتالیز می کنند. بهبود ویژگی ها و فعالیت کاتالیتیک لیپازها به عنوان سومین آنزیم صنعتی دنیا جهت کاربردهای تجاری اهمیت زیادی دارد. مقایسه ساختار ?/? هیدرولازها و لیپازهای ژئوباسیلوسی نشان می دهد که جایگاه اتصال فلز zn2+ (?3 ،b1 و b2) تا کنون در تاخوردگی متعارف ?/? هیدرولازها دیده نشده است. این پژوهش به بررسی اثر حذف مارپیچ ?3 بر فعالیت لیپاز geobacillus thermocatenulatus (btl2) که لیپازی ترموآلکالوفیل است می پردازد. بدین منظور ابتدا مطالعات بیوانفورماتیکی و پیشگویی ساختمان جهت بررسی اثر حذف مارپیچ ?3 بر ساختمان و عملکرد لیپاز انجام شد. پیشگویی عملکرد لیپاز با حذف ناحیه ?3، افزایش فعالیت لیپاز در برابر سوبستراهای 4 تا 10 کربنه را نشان داد. سپس مارپیچ ?3 با روش soe-pcr از ژن لیپاز btl2 حذف شد، بیان ژن لیپاز جهش یافته در مخمر pichia pastoris و خالص سازی با روش کروماتوگرافی تعویض یونی انجام شد. بررسی فعالیت لیپاز جهش یافته نشان داد که حذف ناحیه ?3، فعالیت کلی لیپاز در حضور سوبسترای 4 کربنه (سوبسترای مطلوب این لیپاز) را 8/1 برابر (u/mg 13418)، در حضور سوبسترای 8 کربنه 2/2 برابر (u/mg 10974) و برای سوبسترای 18 کربنه 1/2 برابر (u/mg 3635) افزایش می دهد. ویژگی سوبسترایی به سمت هیدرولیز سوبستراهای بزرگتر تغییر یافت. محدوه فعالیت لیپاز جهش یافته در دماهای 50 تا 60 درجه سانتی گراد و ph 7 تا 10 افزایش یافت. پایداری دمایی لیپاز جهش یافته تغییر چندانی نداشت. یون-های فلزی mn2+ و k+ فعالیت نسبی لیپاز جهش یافته را افزایش دادند اما افزایش فعالیت لیپاز جهش یافته در حضور یون zn2+ بسیار قابل توجه بود در حالیکه یون zn2+ فعالیت لیپاز طبیعی را مهار کرد. فعالیت لیپاز جهش یافته در حضور یون های ca2+ و mg2+ همانند فعالیت لیپاز طبیعی بود و در حضور یون na+ فعالیت لیپاز جهش یافته تغییری نکرد. در حضور حلال های آلی غیر قطبی فعالیت لیپاز جهش -یافته افزایش یافت، اما اثر سورفکتانت ها بر فعالیت لیپاز جهش یافته، همانند لیپاز طبیعی بود. بنابراین از لیپاز جهش یافته می توان جهت کاربرد در بخش های مختلف صنعت استفاده کرد.