جداسازی مایکوپلاسما از جوجه های گوشتی مبتلا به سندروم تنفسی از مرغداری های صنعتی اطراف مشهد

مواد و روش کار 1- در این مطالعه از محیط کشت مایع و جامد pplo، برای کشت نمونه ها استفاده شده است. 2- نمونه برداری جهت کشت 2-1- نمونه برداری ازپرندگان تلف شده نمونه ها از کلینیک تخصصی بخش طیور و کلینیکهای بخش خصوصی اخذ گردید، لاشه های جوجه های گوشتی که در آنها درگیری کیسه های هوایی وجود داشت به صورت تصادفی انتخاب و به طور میانگین از هر گله حدود 4 تا 6 نمونه گرفته و مشخصات مرغداری مربوطه به صورت کامل یادداشت می گردید. در مجموع 150 نمونه از 50 مرغداری اطراف مشهد گرفته شد. اطلاعات فرم هر مرغداری شامل موارد زیر بود: 1- تاریخ نمونه گیری 2- ظرفیت مرغداری 3- نوع پرورش: گوشتی تخم گذار 4- تعداد تلفات 5- سن درگیری گله 6- تعداد نمونه گرفته شده روش نمونه گیری به این صورت بود که ابتدا با دستکش، قسمت های خارجی لاشه را با الکل ضدعفونی و تمیز کرده سپس با قیچی تمیز قسمت های خارجی بخش های مورد نیاز را برش داده تا به کیسه های هوایی و نای و شکاف کامی دسترسی پیدا کرد. سپس با قیچی استریل شده نای را برش داده و یک سوآپ استریل را داخل ترشحات نای زده و نمونه گرفته می شد و بعد سوآپ حاوی نمونه داخل لوله حاوی سرم فیزیولوژی قرار می گرفت. سوآپ بعدی را داخل مجرای بینی فرو برده و از ترشحات داخل بینی هم نمونه گرفته می شد و سوآپ داخل لوله قرار می گرفت. سوآپ بعدی به داخل شکاف کامی زده می شد و نمونه گرفته می شد و سوآپ آخری هم برای کیسه های هوایی بود و از کیسه های هوایی نمونه گرفته می شد. بعد از جمع اوری نمونه ها داخل لوله ها، لوله های مربوطه در جا لوله ای قرار می گرفت و در کنار یخ داخل سبد به آزمایشگاه منتقل می شد. در آزمایشگاه در زیر هود انتقال این نمونه ها به داخل محیط کشت مایع pplo صورت می گرفت به این صورت که ابتدا یک لوله حاوی سوآپ های نمونه در روی شیکر قرار می گرفت تا کل محتوای نمونه ها در روی سوآپ ها پخش شود سپس 2تا سوآپ را برداشته و داخل محیط مایع pplo که به آن nadو cystein اضافه شده بود تلقیح شد و 2 سوآپ دیگر به داخل محیط مایع pplo که بدون nadوcystein بود تلقیح می شد و سپس 2 تا محیط مایع دوباره با فیلتر 0/45 میکرون به داخل لوله های استریل جدید منتقل می شد. در مورد بقیه لوله های حاوی نمونه هم همین روش به کار برده شد و در آخر تمام محیط های مایع با درج مشخصات و تاریخ در روی آنها داخل انکوباتور 37 درجه قرار می گرفت(4،1) 3- کشت وجداسازی پس از قرار دادن نمونه ها در انکوباتور، محیط های کشت روزانه مورد بررسی قرار می گرفت. تغییر رنگ درطی بیست و چهار ساعت اول ناشی از آلودگی باکتریایی یا رشد مایکوپلاسماهای ساپروفیت قلمداد شده و این نمونه ها از انکوباتور حذف می گردیدند. در روزهای بعد هر تغییر رنگی از قرمز به زرد سریعا پاساژ داده شده و مجدد به محیط کشت مایع انتقال داده می شد. نمونه هایی که تا 10روز هیچ تغییر رنگی نداشتند نیز در روز دهم پاساژ داده شده و به محیط مایع منتقل می شدند. محیط های مایع کشت مجدد، به مدت 17 روز در انکوباتور می ماند و روز هفدهم نمونه هایی که تغییر رنگ به سمت زردی داشت به محیط جامد منتقل می شد. بهرحال نمونه های اصلی تا یک ماه در انکوباتور حفظ شده و در صورتی که شواهدی از رشد در آنها یا ساب کالچر آنها مشاهده نمی شد بعنوان نمونه منفی حذف می گردیدند(5،4). 3-1- روش کشت درمحیط جامد روش کشت به این صورت بود که از محیط کشت مایع تغییر رنگ داده، با سرنگ استریل از داخل لوله محیط کشت، مقداری از محیط را برداشته و سپس به فیلتر استریل وصل کرده و انتقال به محیط کشت جامد به طوری که فقط سطح محیط جامد را به صورت یک لایه نازک بپوشاند، صورت می گرفت. محیط های کشت جامد بعد از درج مشخصات نمونه مربوطه و تاریخ در روی آنها در انکوباتور 37 درجه قرار می گرفت و بعد از مدت 7 تا 10 روز پرگنه های مایکوپلاسما مشاهده می شد. به دلیل نداشتن لوپ در آزمایشگاه، پلیت های محیط کشت جامد در شرایط استریل و بدون باز کردن درب آنها در زیر میکروسکوپ قرار گرفته و با بزرگنمایی 10، پرگنه های مایکوپلاسما مورد مشاهده قرار می گرفت (5،4). 4-دسته بندی نمونه ها 4-1- از حدود 50 گله ی طیور گوشتی واز تعداد 150 لاشه ی مرغ گوشتی از قسمت های نای، شکاف کامی، داخل مجرای بینی و کیسه های هوایی انها نمونه گیری صورت گرفت. تمام نمونه های گرفته شده در آنها درگیری کیسه های هوایی و وجود چرک در کیسه های هوایی و پرده اطراف قلب وجود داشت و از لاشه هایی نمونه برداری صورت می گرفت که ترشحات در مجاری هوایی ، نای و برونش ها دیده می شد 4-2-مراحل کشت نمونه ها درمحیط ها 1- کشت اول نمونه های گرفته شده با فیلتر 45/0 میکرون به داخل محیط کشت مایع pplo 2- در طی 24 ساعت بعد از کشت اول نمونه ها در محیط مایع، هر تغییر رنگی در محیط ها از قرمز به سمت زرد، ناشی از الودگی باکتریایی قلمداد شده و این نمونه ها از انکوباتور حذف می گردید. 3- محیط کشت های مایع بعد از قرار گیری در انکوباتور، هر 48 ساعت جهت مشاهده تغییر رنگ مورد بررسی قرار می گرفت. 4- تغییر رنگ ایجاد شده در محیط های کشت مایع، با عدم تغییر رنگ نمونه کنترل که به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شده بود، مقایسه می شد. 5- تغییر رنگ در محیط کشت های مایع حدود 2 تا 3 هفته طول می کشید 6- در صورت مشاهده تغییر رنگ در محیط های کشت مایع، بلافاصله کشت توسط فیلتر در محیط مایع یا جامد pplo صورت گرفت. 7- 7 تا 10 روز بعد از کشت در محیط جامد، پرگنه های مایکوپلاسما در زیر میکروسکوپ با درشت نمایی 10 مورد مشاهده قرار می گرفت(1،3). از کشت تعداد 150 نمونه اخذ شده از 50 گله ی گوشتی، تعداد 16 جدایه مایکوپلاسما، از نمونه ها حاصل شد (66/10%) و تعداد 4 گله از 50 گله ی مورد مطالعه، از نظر آلودگی به مایکوپلاسما مثبت شدند (8%). هر کدام از این 4 مورد مثبت به دست آمده، نتیجه ی کشت تمامی نمونه های گرفته شده از گله ی مربوطه است. تمام نمونه های مربوط به این 4 گله، که مثبت گزارش شدند در کشت اول در محیط مایع، تغییر رنگ از قرمز به سمت زرد را به وضوح نشان می دادند و 7 تا 10 روز بعد از کشت در محیط جامد، پرگنه های مایکوپلاسما در زیر میکروسکوپ با درشت نمایی 10 مورد مشاهده قرار می گرفت. دیدن این کلنی ها، که ظاهری شبیه تخم مرغ نیمرو دارد، تاییدی بر این نتایج است. با استفاده از روش pcr با پرایمر یونیورسال، نتایج مثبت به دست آمده تایید نهایی شد. فقدان رشد مایکوپلاسما در یک محیط رشد غنی، نتیجه فقدان یک ماده غذایی خاص نیست بلکه ناشی از حضور ترکیب یا ترکیباتی سمی برای مایکوپلاسما است. اعتقاد بر اینست که سویه های غیر قابل کشت مایکوپلاسما سویه های سخت گیر خاصی نیستند بلکه انها حساسیت بیشتری به مهارکننده های موجود در محیط کشت بویژه در ترکیباتی همانند پپتون و عصاره مخمر دارند. لذا دو واژه غیر قابل کشت و سخت گیر واژه های نسبی هستند که تنها در مورد یک سیستم کشت خاص که محرکها و احتمالا مهار کننده های رشد وجود دارند قابل تفسیر است(6). یکی از مسائل مهم در جداسازی مایکوپلاسمای پاتوژن پرندگان توجه به حضور مایکوپلاسماهای ساپروفیت به ویژه مایکوپلاسما گالیناسه اوم و مایکوپلاسما گالیناروم می باشد. رشد این مایکوپلاسماها خیلی سریعتر از مایکوپلاسماهای پاتوژن می باشد(7).