استفاده از روش pcr-rflp در ناحیه 5utr ویروس gbv-c جهت شناسایی و تعیین ژنوتیپ های ویروس در افراد مبتلا به hbv مزمن

gbv-c از اعضای خانواده فلاوی ویریده بوده و به تازگی پیشنهاد شده که در جنس جدیدی در این خانواده بنام پگی ویروس طبقه بندی شود. انتشار جهانی این ویروس شایع بوده تا جایی که، بعضی مطالعات یک چهارم جمعیت انسانی را آلوده به این ویروس می دانند. راه های انتقال این ویروس از مسیر خون و فرآورده های آن، مادر به جنین و با میزان بسیار بیشتر نسبت به سایر مسیرها، از طریق جنسی است. از آنجا که راه انتقال این ویروس با عوامل ایجاد هپاتیت (hbv,hcv) و عامل ایدز (hiv) مشترک است، عفونت همزمان این ویروس ها بر حسب جمعیتهای مورد مطالعه شایع می باشد. براساس تنوع در توالی نوکلئوتیدی ناحیه ی 5utrژنوم gbv-c، تاکنون 6 ژنوتیپ از این ویروس شناسایی شده است. ژنوتیپ های آسیایی این ویروس عبارتند از: ژنوتیپ 2،3و6. هدف از این مطالعه بکارگیری روش pcr-rflpبا استفاده از ناحیه ی 5utr ژنوم gbv-c، به منظور تعیین ژنوتیپ های ویروس، در بین افراد مبتلا به عفونت hbv و ارزیابی میزان شیوع این ویروس در جمعیت مورد مطالعه می باشد. برای این مطالعه تعداد 100 نمونه سرمی hbsag مثبت انتخاب شد و پس از استخراج ژنوم gbv-cو ساخت cdna، از آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر ناحیه 237 جفت بازی 5utr ویروس، با روش semi-nested-pcr استفاده شد. در ادامه با استفاده از نرم افزار neb cutter ناحیه اختصاصی مربوط به تمامی 6 ژنوتیپ موجود، در بانک اطلاعات ژنومی را بررسی کرده و مناسب ترین آنزیمها، برای واکنش هضم آنزیمی، که توانایی شناسایی تمامی ژنوتیپ های این ویروس را داشتند، انتخاب شد. در نهایت با دو عدد آنزیم محدود کننده، واکنش هضم آنزیمی روی محصولات مثبت مرحله دوم pcr، انجام گردید. نتیجه حاصل از این مطالعه نشان داد که از 12 نمونه ی دارای عفونت همزمان gbv-cو hbv، 11 مورد به ژنوتیپ 2 و تنها 1 مورد با ژنوتیپ 3 این ویروس، آلوده بودند.نتایج هضم محصول pcrبا آنزیمهای محدودکننده: پس از انجام واکنش هضم آنزیمی، نتایج حاصل از اولین مرحله ی واکنش و استفاده از اولین آنزیم، به گونه ای بود که نیاز به آنزیم ?? ava بطور خودبخودی برطرف شد. بنابراین در این پژوهش از 2 آنزیم ?? draو ?? ban استفاده گردید. محلهای برش آنزیمهای مذکور بروی محصولpcr ، با استفاده از برنامه ی نرم افزاری neb cutter و web cutterتعیین شدند. به این ترتیب مشخص شد که هر کدام از این آنزیمها چه توالی را می برند و در هر کدام از ژنوتیپ ها چند محل برش بر روی توالی ژن دارند. در نتیجه چه قطعاتی و با چه طولی حاصل می شود. افتراق بین باندهای حاصل در ژل، نشان دهنده ژنوتیپ های مورد مطالعه ی ما بودند. در جدول 3-8 طول قطعات حاصل و منطقه ی برش هر کدام از سه آنزیم انتخابی و برش و عدم برش توسط آنها را نشان می دهد. جدول3-8 . طول قطعات و منطقه برش هر کدام از آنزیمها genotype6(bp) genotype5(bp) genotype4(bp) genotype3(bp) genotype2(bp) genotype1(bp) resteriction endonuclase 35,102,100 no restriction site no restriction site 35,102,100 225,15 no restriction site dra ii no restriction site 68و101و68 35,33,169 ava ii no restriction site 106,102,29 ban ?? پس از انجام واکنش هضم آنزیمی بر روی تمامی 12 نمونه ی مثبت از نظر ژنوم gbv-c، وجود برش مناسب و تعیین ژنوتیپ های این ویروس، بر روی ژل آگاروز 2درصد با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید ردیابی گردید. نتایج حاصل نشان دادند که از 12 نمونه مثبت ، 11عدد ژنوتیپ 2 و یک مورد ژنوتیپ 3 بودند. شکل 3- 8 نتایج حاصل از هضم با آنزیم dra?? بر روی ژل آگاروز 2 درصد را نشان می دهد. برای تعیین ژنوتیپ های این ویروس و جهت آسان تر شدن تحلیل نتایج حاصل از هضم آنزیمی بر روی ژل اگاروز، از نمودار3-1 استفاده شد. شکل 3- 8 . هضم با آنزیم dra?? بر روی ژل آگاروز 2 درصد شماره 1- مارکر وزنی100جفت بازی ، شماره های 2،3،4،6،7،8- قطعه 225 جفت بازی نشانگر ژنوتیپ 2، شماره 5- وجود قطعات 100 و102 جفت بازی نشانگر ژنوتیپ3 ، شماره 9 - کنترل منفی، شماره 10- حضور قطعه 237 جفت بازی (عدم برش با آنزیم) به عنوان کنترل مثبت نمودار3-1. مربوط به مراحل انتخاب آنزیمهای محدود کننده در ادامه بدلیل نزدیک بودن فاصله باندهای حاصل از برش با آنزیم ?? ban از الکتروفورز پلی اکریل آمید 12 درصد و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید جهت نمایان سازی قطعات حاصل از برش استفاده کردیم. نتیجه حاصل در شکل 3-9 نشان دهنده تمایز مشخص باند، با استفاده از این نوع الکتروفورز حساس، می باشد. شکل3-9 هضم با آنزیم?? ban و dra?? برروی ژل پلی اکریل آمید 12درصد شماره5 باند 237 جفت بازی(بدون واکنش هضم آنزیمی)، شماره6کنترل منفی، شماره 7 برش با ban ii و ایجاد باندهای 106و135 نشانگر ژنوتیپ3، شماره1و2و 3و 4و 8و9 ، برش با draii و ایجاد باند 225 جفت بازی نشانگر ژنوتیپ2، شماره6 مارکر وزنی 50جفت بازی 3-7 استخراج از ژل: جهت تعیین توالی و برای جلوگیری از وجود هر نوع آلودگی احتمالی و همچنین داشتن نمونه هایی که فقط حاوی نوکلئوتیدهای منطقه ی مورد نظر (utr5) باشند، از کیت ساخت شرکت bioneer استفاده شد. برای این کار ابتدا برروی ژل آگاروز 2%، تمام محصول برای40دقیقه با ولتاژ90 الکتروفورز شد و پس از مشاهده باند ها، محل باند با تیغ جراحی از ژل جداگردید، بنحوی که کمترین میزان ژل همراه نمونه بریده شود و به محدوده باند آسیبی وارد نگردد. این کار با دقت و سرعت انجام گردید .قطعه ژل بریده شده به میکروتیوب 5/1 میلی لیتری منتقل و پس از توزین و محاسبه وزن ژل داخل میکروتیوب، بقیه مراحل طبق پروتکل شرکت سازنده کیت انجام شد. محلول خارج شده از ستون چرخان، حاوی محصول pcr خالص شده، بوده و برای تائید فرآیند استخراج، میزان 2 میکرولیتر از محلول فوق با شرایط قبلی روی ژل ران گردید. بهتر است قبل از ارسال نمونه ها برای تعیین توالی، جذب نوری یا غلظت آنها تعیین گردد و از وجود مقادیر مناسب dna در آن اطمینان حاصل شود. سپس بصورت تصادفی از دو ژنوتیپ شناسایی شده، تعدادی نمونه برای تعیین توالی و در غلظتهای بالا تر از 30 میکروگرم در میلی لیتر، همراه با 20 میکرولیتر از آغازگرهای مشترک خارجی، طبق درخواست شرکت، برای تعیین توالی ارسال گردید. 3-8 تعیین توالی مراحل تعیین توالی در آزمایشگاه ویژه تعیین توالی gottingen gmbh (seqlab) در کشور آلمان انجام گرفت. تعیین توالی با دستگاه خودکار dna 3700 abi prism r محصولی ازکشور آمریکا و بصورت دو طرفه انجام پذیرفت. توالی های ارسالی بعد از عمل تعیین توالی، باتوالی های ثبت شده در بانک ژنومی مربوط به هر ژنوتیپ، الاین شده و هر ژنوتیپی که با آنزیم برش داده شده بود، با توالی های ثبت شده برای آن ژنوتیپ متناسب بود و مکانهای برش آنزیمها در توالی ها شناسایی شد.