بررسی اثر ros بر روی سطح متیلاسیون کلی ژنوم و ژنهای igf2،h19 و mest در اسپرم رت و تأثیر آن بر نرخ ivf و تکوین جنین

مقدمه: امروزه تولید انواع واکنش پذیر اکسیژن(ros) در سیستم تولید مثلی مردان، به یک موضوع قابل توجه تبدیل شده است. این امر به علت اثراتی است که می تواند بر روی کیفیت و عملکرد اسپرم و در نتیجه آن بر روی نرخ ivf و تکوین جنین ها گذارد. از طرف دیگر نظریه رادیکال های آزاد در تکوین بیان می دارد که ros می تواند سبب تغییر در الگوهای متیلاسیون شود. از این رو در این مطالعه اثر ros برروی حرکت و تعداد اسپرم ها مورد بررسی قرارگرفته و ارتباط آن با نرخ ivf و تکوین جنین ها در محیط in vitro نیز بررسی شده است. همچنین سطح متیلاسیون اسپرم در لوکوس های ژنی h19، igf2 و mest و متیلاسیون کلی ژنوم اسپرمی نیز مورد بررسی قرار گرفته است. روش ها: رت ها در دو گروه کنترل(متشکل از 11 نمونه) و آزمون(متشکل از 16 نمونه) دسته بندی شدند. پس از تعیین دوزکشنده 50 درصد(ld50)، جهت القاء ros مقادیر مناسبی از tbhp به مدت 14 روز به رت های نر آزمون، به صورت درون صفاقی تزریق شد. سپس ros القاء شده در اسپرم به کمک فلوسایتومتر اندازه گیری شد. پس از شمارش و تعیین وضعیت حرکت در اسپرم ها، از آن ها برای انجام ivf و بررسی های مولکولی استفاده شد. وضعیت پیش روی جنین های حاصل از ivf نیز تا مرحله هشت سلولی مورد بررسی قرارگرفت. بررسی های مولکولی شامل: بررسی وضعیت بیانی و تعیین الگوهای متیلاسیون نواحی cpg مربوط به ژن های h19، igf2 و mest در اسپرم و همچنین وضعیت متیلاسیون کلی ژنوم بود. برای بررسی وضعیت متیلاسیون و بیان کمی این ژن ها به ترتیب، روش تعیین توالی بی سولفیت و real-time rt-pcr مورد استفاده قرارگرفت. وضعیت متیلاسیون کلی ژنوم نیز براساس واکنش آنتی ژن-آنتی بادی و با کمک فلوسایتومتر اندازه گیری شد. یافته ها: پس از تزریق مقادیر مناسبی از tbhp، میزان ros در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل افزایش معناداری را نشان می داد. تعداد و تحرک اسپرم ها، نرخ لقاح و وضعیت پیش روی جنین ها در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل به طور معناداری کاهش یافته بود و بین افزایش ros و کاهش یافتن تعداد و تحرک اسپرم ها و نرخ لقاح در گروه آزمون، ارتباط معناداری وجود داشت. بررسی الگوهای متیلاسیون نیز نشان می داد که سطح متیلاسیون cpgها در ناحیه تنظیمی ژن mest و سطح متیلاسیون کلی ژنوم در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل به طور معنادار افزایش یافته است. همچنین بین افزایش ros و هایپرمتیله شدن کلی ژنوم و ژن mest نیز در گروه آزمون ارتباط معنادار وجود دارد. نتیجه گیری: این مطالعه نشان می دهد که القاء ros در اسپرم رت ها برروی تحرک و تعداد اسپرم ها اثر منفی می گذارد. همچنین نرخ لقاح را کاهش داده و بر روی وضعیت پیش روی جنین های حاصل از ivf نیز اثر منفی دارد. به علاوه به نظر می رسد که سبب هایپرمتیله شدن ناحیه تنظیمی ژن mest و افزایش سطح متیلاسیون کلی ژنومی نیز می شود.