بررسی اثرمهار کنندگی عصاره هیدرواتانولی برگ زیتون(olea europaea) و ترکیب اصلی آن (اولئوروپئین) بر ایجاد تحمل و وابستگی به مرفین در موش های بزرگ آزمایشگاهی

نشان داده شده است که بلوکر های کانال کلسیم می توانند از بروز تحمل به اثرات ضد دردی و وابستگی به مرفین جلوگیری کنند. از طرفی به دنبال تجویز مزمن مرفین التهاب نورونی و استرس اکسیداتیو در سیستم عصبی رخ می دهد. اخیرا مشخص شده است که عصاره برگ زیتون دارای خاصیت بلوکه کنندگی کانال های کلسیم، ضد التهابی و آنتی اکسیدانی می باشد. با این حال، اثرات آن بر روی تحمل و وابستگی اوپیوئیدی هنوز مشخص نشده است. برای القاء تحمل به اثر ضد دردی مرفین در رت های نر نژاد ویستار، مرفین با دوز10 میلی گرم بر کیلوگرم (i.p) به مدت هشت روز در دو نوبت تزریق می شود. برای تعیین اثر عصاره و ترکیب اصلی آن یعنی اولئوروپئین بر روند ایجاد تحمل به اثر ضد دردی مرفین، عصاره با دوزهای50، 100 و 200 (i.g) و اولئوروپئین با دوز 5 و 10 میلی گرم بر کیلوگرم (i.p.) همراه مرفین تجویز شد. از تست tail-flickبرای سنجش آستانه درد قبل و30 دقیقه بعد از تزریق مرفین در روز های اول، سوم، ششم و هشتم استفاده شد. بیان زیر واحد 1d? کانال های کلسیم نوع -l (cav1.3?1) در قسمت پشتی نخاع کمری با تکنیک rt-pcr مورد بررسی قرار گرفت. برای القای وابستگی مرفینی، مرفین به مدت یک هفته در دو نوبت بر طبق دوزهای افزایشی تزریق شد. تجویز مرفین با دوز 5/2 شروع شد و هر روز دوبرابر شد تا اینکه در روز ششم به 40 میلی گرم بر کیلوگرم رسید. در روز هفتم که آخرین روز تزریق بود 50 میلی گرم بر کیلوگرم مرفین تزریق شد. 5 ساعت بعد حیوان ها نالوکسان (3 میلی گرم بر کیلو گرم) دریافت کردند. علامت های سندرم ترک ( کاهش وزن، دل پیچه، اسهال، دندان قروچه، پرش و پتوزیس) به مدت یک ساعت بعد از تزریق نالوکسان ارزیابی گردید. برای تعیین اثر عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین بر ایجاد وابستگی مرفینی، عصاره با دوزهای 200، 300 و 500 میلی گرم بر کیلوگرم و اولئوروپئین با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم همراه با مرفین تجویز شد. نتایج ما نشان داد که تزریق مزمن مرفین موجب بروز تحمل به اثر ضد دردی و وابستگی فیزیکی در موش های بزرگ آزمایشگاهی می شود عصاره با دوز 200 و اولئوروپئین با دوز 10 میلی گرم بر کیلو گرم به طور کامل از ایجاد تحمل مرفینی جلوگیری می کند. در بررسی علامت های سندرم ترک مرفینی مشخص شد که عصاره با دوز 300 و اولئوروپئین با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم توانست این علائم را کاهش دهد. در حیواناتی که تحمل مرفینی القاء شده، سطح mrna کانال های کلسیم به طور معنی داری افزایش می یابد و عصاره با دوز 200 و اولئوروپئین با دوز 10 میلی گرم بر کیلو گرم این افزایش را معکوس می نماید. در مجموع نتایج حاکی از آن است که، عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین یک اثر مفید روی اثرات جانبی یعنی مصرف مزمن مرفین، تحمل و وابستگی فیزیکی القاء شده دارد و یکی از مکانیسم های مرتبط حداقل بخشی از آن ممکن است، کاهش بیان و فعالیت کانال های کلسیم نوع l باشد. تا اوایل سال 1970 سیستم های اوپیوئیدی درون زا ناشناخته بودند و عملکرد مرفین، هروئین و دیگر اوپیوئیدها به عنوان ضد درد و عوامل اعتیادزا در ارتباط با انگیزش، با دیگر سیستم های مواد میانجی نورونی از قبیل مونوآمینرژیک و کولینرژیک بررسی می شدند. شواهد مربوط به تحریک و از میان رفتن اثر اوپیوئیدها توسط نالوکسان منجر به کشف گیرنده های اوپیوئیدی درون زا گردید(hyman & malenka., 2001). بعد از کشف پپتیدهای اوپیوئیدی درونزاد (آندوژن)، با انجام آزمایشات فارماکولوژیک در بافت های ایزوله انواع متعدد گیرنده های اوپیوئیدی مشخص شدند(lord et al., 1977). در این گونه مطالعات سه نوع اصلی گیرنده های اوپیوئیدی، یعنی µ، ? و ? شناسایی شدند و ژنهای مسئول آنها مشخص گردید برای هر یک از این گیرنده ها آگونیست ها و آنتاگونیست هایی وجود دارند که بیش از 1000 بار انتخابی می باشند(goldstein & naidu., 1989). لازم به ذکر است که در طول سه دهه گذشته انواع دیگری از گیرنده های اوپیوئیدی پیشنهاد شدند، ولی وجود آنها از نظر ملکولی به اثبات نرسید. مطالعات فارماکولوژیک تلاش کرده اند تا هر دسته از گیرنده های اوپیوئیدی را به دستجات کوچکتر تقسیم نمایند و در این مسیر زیر گروه هایی از گیرنده های µ، ? و ? پیشنهاد شده اند (حداقل سه نوع گیرنده مو، دو نوع گیرنده دلتا و دست کم چهار نوع گیرنده کاپا بر اساس مطالعات فارماکولوژیک در شرایط in vivo و in vitro به اثبات رسیده است(pasternak., 2005). گیرنده های اوپیوئیدی µ و ? به طور وسیعی در سطح غشاء پلاسمایی جسم سلولی، دندریت ها و پایانه های عصبی پراکنده می باشند. گیرنده ? در این زمینه متفاوت بوده و غالبا در درون سلول و در ارتباط با وزیکول ها یافت می شود(zhang et al., 2009). تغییر پراکنش وابسته به فعالیت درگیرنده های µ و ? از وزیکول ها به غشاء پلاسمایی این احتمال را مطرح می سازد که مکان گیرنده ها استاتیک نیست و به طور قابل توجهی در رابطه با فعالیت سلول تغییر می کند. گیرنده های اوپیوئیدی جزء گیرنده های متصل به پروتئین جی می باشند. این گیرنده ها دارای هفت دمین غشائی، یک دمین داخل سلولی قابل ملاحظه بین قسمت پنجم و ششم دمین غشائی، یک قسمت آمینه انتهایی (n-terminal) خارج سلولی و یک قسمت کربوکسیله انتهایی (c-terminal) داخل سلولی می باشند. سیگنالینگ داخل سلولی این رسپتورها از طریق اتصال آنها به پروتئین های جی صورت می گیرد. بین این گیرنده های اوپیوئیدی µ، ? ، ? بیش از 60 درصد شباهت ساختمانی وجود دارد(pasternak., 2005). 1-2 عملکرد داخل سلولی گیرنده های اوپیوئیدی جفت شدن سه نوع گیرنده اوپیوئیدی به پروتئین جی مشابه است، اما تفاوتهای اندکی نیز تشخیص داده شده است. مشترک ترین پیامدهای جفت شدن گیرنده های اوپیوئیدی با پروتئین های جی عبارتند از: مهار آدنیلیل سیکلاز، فعال شدن جریان پتاسیمی، مهار جریان کلسیمی و مهار رهایش ترانسمیترها( nestler & carlezon., 2006). رسپتورهایµ، ?، ? به کانال های پتاسیم متصل می باشند. اتصال آگونیست های رسپتور ? می تواند منجر به بسته شدن کانال کلسیم و منع ورود کلسیم گردد. در حالی که آگونیست های µ و ? بیشتر از طریق افزایش خروج پتاسیم اثر مهاری خود را اعمال می کنند(margolis et al., 2006). مطالعات نسبتا جدید تر، حوزه کارکرد اوپیوئید ها را بسط داده اند به طوری که این کارکرد ها شامل فعال شدن پروتئین کیناز c، رهایش کلسیم از منابع داخل سلولی، فعال شدن آبشار پروتئین کیناز فعال شونده با میتوژن نیز می شوند( galeotti et al., 2006). 1-3 پراکندگی گیرنده های اوپیوئیدی در سیستم عصبی: از آنجایی که گیرنده های اوپیوئیدی به طور وسیعی در تمامی قسمت های سیستم عصبی گسترده شده اند، می توان احتمال دادکه عملکردهای خود را از طریق مکانیسم های متعددی به انجام می رسانند؛ مطالعات اتورادیوگرافیک و هیبریدیزاسیون درجا مشخص کرده است که mrna مربوط به گیرنده های اوپیوئیدی در بسیاری از نواحی قشری، دیانسفال، ساقه مغز و نخاع وجود دارند(snyder & pasternak., 2003). نواحیی که در آنها گیرنده های اوپیوئیدی بیان می شوند شامل قشر پیش بینایی ، هسته اکومبنس، هیپوکمپ، تالاموس و هیپوتالاموس می باشند. دو ناحیه ای مهم در بروز اثرات ضد دردی اوپیوئیدها در سطوح فوق نخاعی شامل ناحیه خاکستری دور قناتی (pag) و ناحیه (pvm) rostral ventromedial medula می باشد. pag حاوی گیرنده های اوپیوئیدی مو فراوانی است در حالی که گیرنده های دلتا و کاپا در این ناحیه بسیار کم می باشد .(mansour et al., 1994) علاوه بر این ها گیرنده های اوپیوئیدی در لوکوس سرلئوس نیز وجود داشته و نقش قابل ملاحظه ای در پردازش ورودی های درد دارند(williams et al., 2001). هیپوتالاموس میانی که مسئول رله کردن اطلاعات به قشر مغز بوده و بیشتر درگیر فرایندهای هیجانی درد است دارای گیرنده های اوپیوئیدی به مراتب بیشتری در مقایسه با هیپوتالاموس کناری ( مسئول پردازش اطلاعات حس لمس و دردهای سوزشی) می باشد که تحت تأثیر اوپیوئیدها قرار نمی گیرد. نواحی لیمبیک مغز مانند آمیگدال که رفتارهای هیجانی را تنظیم می نمایند، دارای گیرنده های اوپیوئیدی فراوانی می باشند(snyder & pasternak., 2003). پیام های درد پس از ورود به نخاع بوسیله نورون های واسطه و همین طور نورون های مهاری نزولی از نواحی فوق نخاعی (فعال شده توسط اوپیوئیدها) تنظیم می گردند. گستردگی و محل گیرنده های اوپیوئیدی در نخاع توسط روش های متعددی از جمله اتورادیوگرافی، اتصال با لیگاندهای رادیواکتیو، هیبریداسیون درجا و ایمنوهیستوشیمی در طول سالیان گذشته مشخص شده است. مطالعات اتورادیوگرافیک نشانگر تمرکز گیرنده های اوپیوئیدی در لامینای خارجی شاخ خلفی نخاع می باشند(besse et al., 1991). مطالعات تکمیلی نشان می دهد که گیرنده های اوپیوئیدی µ در لامینای خارجی شاخ خلفی نخاع متراکم شده اند در حالی که گیرنده های دلتا به طور منتشری در شاخ خلفی وجود دارند. گیرنده های کاپا بیشتر در لامینای بیرونی شاخ خلفی در قسمت کمری- خاجی نخاع قرار گرفته اند و دارای وابستگی نزدیکی با ورودی های درد از احشاء می باشد (gray et al. 2006). تکنیک های ایمنولیبلینگ اطلاعات دقیق تری از محل گیرنده های اوپیوئیدی در سیستم عصبی به ما نشان می دهند و محل قرار گیری و همچنین وجود گیرنده های مختلف اوپیوئیدی را در نورون های مشابهی مشخص می نمایند. هر سه نوع گیرنده اوپیوئیدی در فیبرهای a?,c ریشه خلفی نخاعی دیده شده اند(arvidsson et al., 1995). عقیده بر این است که تزریق داخل نخاعی مرفین از طریق اثر بر گیرنده های اوپیوئیدی موجود بر روی ترمینال های مرکزی فیبرهای اولیه c عمل نموده و سبب بی دردی می شود(ossipov et al., 2004). تکنیک پچ کلمپ نشان داد که فعال شدن گیرنده های اوپیوئیدی سبب مهار کانال های کلسیمی نورون هائی با قطر کم می شود ولی اثری بر نورون های قطور ندارد. بدین معنی که فعال شدن گیرنده اوپیوئیدی به طور اختصاصی فعالیت فیبرهای c را کاهش خواهد داد(taddese et al., 1995)