تعیین بار میکروبی اشریشیا کلی در منابع آبی زنجان با استفاده از pcr بلادرنگ

آب به عنوان ماده اصلی تشکیل دهنده پیکره موجودات زنده مصرف فراوانی برای تمام موجودات دارد و بشر از منابع آبی گوناگون، بسته به مورد نیازمندی خود استفاده های مختلف می نماید، که مهمترین این مصارف، مصرف جهت آشامیدن و تامین نیاز آب بدن و نیز مصرف برای کِشت های زراعی و باغی خود است که به عنوان جزء لاینفک حیات محسوب می شوند. بررسی های اپیدمیولوژیک نشان داده است که مصرف آب آلوده و جذب میکروارگانیسمهای آبزی بیماریزای موجود در آب آلوده از طرق مختلف از جمله جذب از طریق سیستم گوارش و پوست انسان، می تواند باعث ابتلا به بیماریهای خطرناک و همه گیر گردد. به ویژه در مورد آب آشامیدنی قبل از قرار گرفتن در سیستم توزیع و مصرف، بایستی از نظر وجود عوامل بیماریزا به دقت مورد بررسی و آزمایش قرار گیرد؛ اما متاسفانه اغلب روشهای مرسوم کنونی که مدتهاست مورد استفاده قرار می گیرند، به دلایل مختلف قادر نیستند با دقت بالایی فرض فوق را مورد آزمون قرار دهند. روشهایی که به منظور کیفیت سنجی میکروبی آب آشامیدنی مورد استفاده قرار می گیرند به دو دسته تقسیم بندی می شوند: 1- روشهای مبتنی بر کشت میکروارگانیسم در محیط کشت 2- روشهای غیر مبتنی بر کشت میکروارگانیسم در محیط کشت روشهای مبتنی بر کشت میکروارگانیسم به طور متداول در آزمایشگاههای کنترل کیفی مورد استفاده قرار می گیرد؛ ولی به دلیل محدودیتهایی که در انجام این روشها وجود دارد، از جمله طولانی بودن زمان انکوباسیون(این زمان در مورد باکتریهایی که سرعت رشد کندتری دارند بیشتر می شود)، طولانی و وقتگیر بودن مراحل آزمایش، مشکل بودن تفسیر نتایج به دلیل امکان ایجاد تداخل توسط باکتریهای هتروتروف، از کارایی چندانی برخوردار نیستند. همچنین به دلیل مخلوط بودن تعدادزیادی از انواع میکروبهای ساپروفیت و بی ضرر(که جزو فلور طبیعی بدن موجود زنده هستند) و تعداد کم میکروبهای خطر ساز از نظر تولید انواع بیماریها، ضریب اطمینان آزمایشهای کیفیت سنجی آب به میزان قابل توجهی کاهش می یابد. پژوهشگران برای غلبه بر این محدودیتها ، روشهای جدیدی را گسترش دادند. از جمله ی این روشها ، روشی است که سنجش میزان باکتریهای اشریشیاکلی و باکتریهای کلی فرم را براساس سنجش سرعت فعالیت آنزیمی تخمین می زنند در این روش با اندازگیری فعالیت آنزیمی ?-d-galactosidase (galase) یا ?-d-glucuronidase ( gluase ) بدون استفاده از محیط های کشت انتخابی ، می توان به سرعت میزان کلی فرم ها و اشرشیاکی را تخمین زد. از عوامل محدود کننده این روش سوبستراهای فلورسانس و رنگی، دستگاهها و تجهیزات گرانقیمت را می توان ذکر کرد. بنابراین معرفی روشی سریع و دقیق برای شناسایی انواع میکروارگانیسمهای موجود در آب (به ویژه آب آشامیدنی)، حتی در حد چند عدد در لیتر آب، ضروری به نظر میرسد.در روشهای غیر وابسته به کشت میکروارگانیسم، برای شناسائی میکروب نیازی به تکثیر میکروب نیست و شناسایی بر پایه وجود یا عدم وجود dna و rna انجام می گیرد. بیشتر تکنیکهایی که د ر این گروه قرار می گیرند یا بر پایه واکنشهای زنجیره ای پایه گذاری شده اند یا بر پایه تکنیک های هیبریداسیون اسید های نوکلئیک. روش معرفی شده در این تحقیق با عنوان real-time pcr، برای کیفیت سنجی آب از لحاظ شناسایی تعداد بسیار اندک و انگشت شمار میکروارگانیزمهای مضر و بیماریزا کارایی کافی و خوبی دارد و قادر است بسیاری از معایب روشهای فوق الذکر را پوشش داده و به عنوان روشی نو برای معرفی استاندارد جدید و معتبری برای بار میکروبی آب مورد استفاده قرار گیرد. روش real time pcr توسط توبیاس بلین و همکاران (2001) برای تعین میزان e. coli موجود در منابع مختلف با استفاده از ژن stx1 به کار گرفته شد. این روش توسط ای. مارک ایبک و همکاران (2002) برای ردیابی و پیدا کردن باکتری اشرشیا کلی از ضایعات آبی منطقه وتلند آمریکا و با استفاده از ژن stx2، به کار رفت. زوفو و همکاران (2004) نیز از این روش برای پیدا کردن وتعیین میزان باکتری مذکور و باکتری salmonella spp. به همراه روش ایمنی سنجی و با هدف قرار دادن ژن eaea استفاده نمودند. روش real time pcr به عنوان روش چاره مناسبی که می تواند جایگزین pcr معمولی جهت ردیابی باکتری salmonella spp. در منابع آبی و غذایی گردد، توسط هین و همکاران (2006) معرفی گردید. دی. ام. وِست و همکاران (2007) توانستند با به کار گیری این روش و هدفگیری ژنهای بیماریزایی (از جمله ژن gad) در e. coli ،موفق به پیدا کردن کمیتهای جزئی این باکتری در منابع آبی گردیدند. در مقاله پژوهشی آی. ام. مک کِی(2002) نیز بر کارایی روش real time pcr در تحقیقات میکروبیولوژیکی و تعیین دقیق بار میکروبی موجود در منابع مختلف از جمله منابع آبی اشاره و تاکید شده است.برای مشخص کردن آلودگی آب آشامیدنی انواعی از باکتریهائی را که بطور طبیعی در روده انسان و حیوانات بسر می برند، از جمله: کلی فرمها شامل اشریشیاکلی ، کلی فرم گرماپا ، کلستریدیوم های احیاکننده سولفیت، آنتروکوک های مدفوعی را در نظر می گیرند