بررسی تغییرات میل ترکیبی آنتی بادی بر علیه گیرنده لپتین بوسیله جهش های نقطه ای هدفمند بررسی مولکولار اپیدمیولوژی سویه های اسینتوباکترspp وشیگلا سونه ای با روشهای ap-pcr و rapd-pcr وحساسیت ضدمیکروبی آنها

لپتین یک هورمون پپتیدی با وظایف چندگانه است که عمدتاً توسط بافت چربی ترشح می شود. این هورمون به عنوان یک رابط بین حالت تغذیه ای و سیستم ایمنی عمل می کند. هورمون لپتین علاوه بر دارا بودن نقش های فیزیولوژیکی مختلف دارای عملکردهای مهمی در سیستم ایمنی بدن می باشد، از جمله:شرکت در ایمنی ذاتی و اکتسابی بهبود پاسخ های تکثیری لنفوسیت های t ، تحریک تولید سایتوکاین های پیش التهابی و شرکت در برخی از بیماری های خود ایمن نظیر مولتیپل اسکلروزیس و دیابت. با توجه به گسترش روز افزون بیماری های خود ایمن و نقش هورمون لپتین در بروز این بیماری ها مهار عملکرد این هورمون ممکن است اثرات مثبتی بر این بیماری ها داشته باشد. در این تحقیق، آنتی بادی نوترکیبی که بر علیه گیرنده لپتین ساخته شده و دارای خاصیت مهاری برای گیرنده است ،در یک پلاسمید کلون گردیده و توسط میزبان باکتریایی e. coli بیان و تولید شد. هدف از این پژوهش در مرحله اول ایجاد جهشهای نقطه ای هدفمند درقسمت های بسیار متغیرشماره 3 زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی وارزیابی میزان تغییرات ایجاد شده درمیل جذبی آنتی بادی نسبت به گیرنده اش بود. مولکولار اپیدمیولوژی سویه های شیگلا سونه ای و آسینتوباکتربومانی در بیمارستانهای تهران با استفاده از روشهای انگشت نگاری rapd-pcr و ap-pcr نیز در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفت . برای ایجاد جهش در زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی ، در قسمت بسیار متغیرسوم زنجیره سبک در جایگاه 84 اسید آمینه آسپاراژین رابا ایزولوسین جایگزین نمودیم . در مرحله دوم در قسمت بسیار متغیر سوم زنجیره سنگین در موقعیت 98 اسید آمینه آسپارتیک اسید رابا هیستیدین جایگزین نمودیم و در مرحله سوم هردو جهش را بطور همزمان در هردو زنجیره ایجاد نمودیم. پس از ایجاد جهش هردو زنجیره را در وکتور فاژمیدی pcomb3 وارد و آنرا در باکتری e.coli وارد نمودیم وپس از تولید آنتی بادی و خالص سازی آن با استفاده از تکنیکهای الیزا، فلوسیتومتری و بیوانفورماتیک، تغییرات ایجاد شده در میل ترکیبی آنتی بادی را محاسبه نمودیم. اندازه گیری میزان kd آنتی بادیها با روش الیزا غیرمستقیم نشان داد که در اثر ایجاد جهش در زنجیره های سبک، سنگین، و هردو زنجیره بطور توام، میل ترکیبی آنتی بادیها به ترتیب 1/3 برابر و 8/1 برابر و 25 برابر افزایش یافته است. درحالیکه بررسی های فلوسایتومتری و بیوانفورماتیک افزایش بیش از 100 برابری درعملکرد آنتی بادی را نشان میدادند. در بررسی مولکولار اپیدمیولوژی سویه های شیگلا سونه ای جدا شده از بیمارستانهای تهران،تعداد459 نمونه از بیماران مبتلا به اسهال خونی مراجعه کننده به بیمارستانهاجمع آوری شدو با استفاده از تستهای بیوشیمیائی و سرولوژی مورد ارزیابی قرار گرفتند. از مجموع 459 نمونه 80 نمونه مبتلا به شیگلوز بودند که تعداد 60 نمونه (75 %) آلوده به شیگلا سونه ای و15 نمونه (75/18 %) شیگلا فلکسنری و2 نمونه(5/2 %) شیگلا بویدی ای و3 نمونه (75/3 %) آلوده به شیگلا دیسانتری بودند. نتایج آنتی بیوگرام نشان داد که بیش از 96% سویه ها (58 نمونه) مقاوم به کوتریموکسازول ونالیدکسیک اسید بودند در حالیکه 100% ایزوله ها حساس به سیپروفلوکسازین، جنتامایسین و سفتریاکسون بودند و تعداد51 سویه(85%) حساس به آموکسی سیلین وتتراسیکلین و تعداد59 سویه (98%) به تری متوپریم حساس بودند. این 60 بیمار مبتلا به شیگلا سونه ای شامل 36 پسر(60%) و24 دختر(40%) بودند. این بیماران دارای سن زیر 11 سال بودند وبه 5 گروه سنی تقسیم شدند که بیشترین تعداد 39 بیمار(65%) در گروه 1 قرارداشتند و کمترین میزان شیوع 1نفر در گروه سنی بالای 9 سال قرار داشتند. براساس یافته های انگشت نگاری rapd-pcr هر60 نفر در 5 گروه قرارگرفتند که بیشترین تعداد درگروه 1 شامل 39 بیمار(65%) بودند که نشاندهنده قرابت ژنتیکی نزدیک بین سویه ها بود یا اینکه احتمالا این افراد منبع آلودگی مشترکی داشته اند. در بین بیماران بستری شده در بیمارستانهای تهران 67 سویه اسینتوباکتر جداشد که 21 سویه اسینتوباکتر بومانی و46 سویه غیر اسینتوباکتر بومانی بودند. بررسی الگوی حساسیت نسبت به انتی بیوتیکها نشان داد که سویه های اسینتوباکتر بومانی دارای الگوی مقاومت چند آنتی بیوتیکی هستند و درنهایت نسبت به 11 آنتی بیوتیک مختلف مقاومت نشان میدادند وبرهمین اساس به الگوهای a? i تقسیم بندی شدند. در میان این الگوها، الگوی g بیشترین میزان مقاومت را نشان میداد که از نمونه های ادراری بدست آمده بود. الگوهای hو i بیشترین میزان حساسیت به آنتی بیوتیکها را نشان دادند که بترتیب از نمونه های خون ومجاری تنفسی جدا شده بودند. در مقابل سویه های غیر اسینتوباکتر مقاومت کمتری را نسبت به آنتی بیوتیکها از خود نشان میدادند. در نهایت این باکتریها براساس انگشت نگاری ap-pcr هفت الگوی مولکولی را از نظر باندهای تولید شده نشان دادند. در نتیجه روشهای مولکولی rapd-pcr و ap-pcr میتوانند بعنوان روشهائی ارزشمند، سریع ، قابل تکرار و قابل اعتماد در مطالعات اپیدمیولوژیکی مورد استفاده قرار بگیرند. کلمات کلیدی: آنتی بادی نوترکیب، گیرنده لپتین،جهش های نقطه ای هدفمند،شیگلا سونه ای، اسینتوباکتر.