بررسی خاموش سازی ژن به روش القایی توسط ویروس (vigs) در گیاه تنباکو به منظور خاموش سازی ژن pds در گیاهtaxus baccata l. و مطالعه اثرات آن بر میزان سنتز ماده تاکسول و برخی پارامترهای فیزیولوژیکی رشد

چکیده در سال های اخیر، استفاده از خاموش سازی ژن با تحریک ویروسvigs (virus induced gene silencing) به عنوان یکی از ابزارهای قدرمتند ژنومیکس برای خاموش نمودن موقت ژن های گیاهی و بررسی عملکرد آن ها بسیار رو به گسترش بوده است. بیشتر تحقیقات صورت گرفته در این راستا به آزمودن کارا بودن وکتورهای vigs از پیش موجود در میزبان های جدید گیاهی معطوف بوده است. از سوی دیگر برخی از محققین اقدام به ساخت وکتورهای جدید ویروسی نموده اند که قادر به عملکرد در میزبان های مربوط به آن ها باشد. رویکردی که در این تحقیق دنبال شده استفاده از یک سیستم خاموش سازی هترولوگ یا ناجور می باشد که در آن از توالی یک گیاه (که فاقد سیستم vigs بهینه است) برای خاموش سازی ژن همولوگ یا مشابه آن در گونه گیاهی دیگر (که روش vigs در آن بهینه شده) استفاده می شود. در این پژوهش توالی هایی از ژن فیتوئن دساچوراز (pds) از یک گیاه بازدانه (taxus baccata l.) جدا شده و در داخل وکتورهای ساخته شده از ویروس trv (tobacco rattle virus) همسانه سازی شد. پس از انتقال به آگروباکترویم از این سیستم برای خاموش سازی ژن همولوگ pds در گیاه تنباکو (nicotiana benthamiana) استفاده شد. نتایج نشان داد که قطعات ژن جدا شده از گیاه سرخدار که بین 400 تا 700 نوکلئوتید طول داشتند (356، 390، 578، 724 و 857 نوکلئوتید) توانستند ژن همولوگ در تنباکو را خاموش کنند. بر اساس نتایج real time pcr سطوح mrna این ژن در تنباکو پس از انجام vigs، کاهشی 1/2 تا 0/4 برابری را نسبت به شاهد نشان داد. نتایج نشان داد که توالی-های با اندازه 390، 578 و 724 نوکلئوتید باعث خاموش سازی بیشتری را در ژن فیتوئن دساچوراز تنباکو نسبت به دو توالی حد پایینی (توالی 356 نوکلئوتیدی) و حد بالایی (توالی 875 نوکلئوتیدی) باعث شده اند. بر اساس اطلاعات ما این گزارش اولین مطالعه در مورد بهینه سازی توالی انتخابی یک ژن برای خاموش سازی در سیستم هتروژن می باشد. با مقایسه نتایج حاصل از vigs هتروژن و vigs هموژن (حالتی که ژن تنباکو برای خاموش سازی در همان گیاه استفاده شود) نشان داده شد که vigs هتروژن نسبت به روش هموژن تاثیر بسیار کمتری بر کاهش پارامترهای فیزیولوژیکی رشد اعمال می کند. تاثیر حداقلی vigs هتروژن بر پارمترهای رشد این سیستم نشان داد که استفاده از این سیستم برای خاموش سازی ژن هایی که سرکوب کامل آن ها با روش هموژن باعث کاهش شدید رشد و یا حتی مرگ گیاه می شود، بسیار مناسب است. در بخش دیگر این پژوهش برای بررسی امکان پذیر بودن vigs هموژن در گیاه سرخدار، توالی 390 نوکلئوتیدی جدا شده از این گیاه برای انجام خاموش سازی موقت ژن فیتوئن دساچوراز در وکتور trv همسانه سازی شد. از آنجا که برای انجام vigs در یک گیاه ایجاد گیاهچه های گیاه مورد نظر از بذر ضروری است و با توجه به اینکه بذرهای گیاهان سرخدار دارای خواب سنگین بوده و گیاهچه ها رشد بسیار کندی دارند، لذا از دو روش جداسازی و کشت جنین (بصورت درون شیشه ای) و کشت هیدروپونیک برای ایجاد گیاهچه های سرخدار استفاده شد. با سیستم بهینه شده این پژوهش درصد جوانه زنی جنین های جدا شده از بذرهای سرخدار به 100 رسید بدون اینکه هیچ گونه آلودگی در کشت ها مشاهده شود. نتایج نشان داد که تیمار اسید و شستشوی آن ها در آب جاری برای 7 روز بیش از آنکه بر درصد جوانه زنی جنین های جدا شده از آن ها تاثیر مثبت داشته باشد، بر نمو بعدی گیاهچه های تولید شده موثر می باشد. جنین های جدا شده از بذرهای شسته شده جوانه زنی طبیعی را نشان دادند و دارای ریشه های گسترش یافته بودند، در حالیکه جنین های شسته نشده، درصد جوانه زنی پایینی داشته و اغلب شکل غیرطبیعی (با ریشه های کمتر توسعه یافته) داشتند. همچنین جنین های کشت شده در محیط های حاوی یک ماده جذب کننده ترکیبات فنلی (pvp یا زغال فعال) نسبت به جنین های کشت شده در محیط های فاقد جاذب دارای ریشه ها و ساقه گسترش یافته تر و اندازه بزرگتر بوده و پدیده قهوه ای شدن کمتری را نشان دادند. از این حیث، کاربرد زغال فعال نسبت به pvp تاثیرات بهتری داشت. برای بررسی شدت عناصر ماکروی موجود در محیط کشت روی جوانه زنی جنین های سرخدار از دو محیط ms و محیط ms 2/1 (با غلظت عناصر ماکروی نصف محیط ms) استفاده شد. نشان داده شد که اگرچه درصد جوانه زنی جنین ها روی هر دو محیط تفاوتی نمی کرد (در هر دو محیط،100 درصد جوانه زنی مشاهده شد) ولی شدت عناصر ماکرو روی نمو بعدی گیاهچه ها تاثیر داشت. جنین-های نمو یافته روی محیط ms دارای بخش های هوایی توسعه یافته تر و ریشه های کمتر توسعه یافته بودند، برعکس، در محیط ms2/1، ریشه گستردگی بیشتر و بخش های هوایی رشد کمتری نشان دادند. پس از انتقال گیاهچه های تولید شده به روش درون شیشه ای به کشت هیدروپونیک حدود 90 درصد گیاهچه ها زنده مانده و به رشد خود ادامه دادند. برای انجام vigs روی این گیاهچه ها، آگروباکترویم حاوی وکتور trv دارای ژن سرخدار با دو روش تزریق (m1 و m2) تزریق شدند. نتایج حاصل از real time pcr نشان داد که تزریق وکتورهای حاوی ژن سرخدار با هیچ کدام از این دو روش نتوانسته بود کاهشی در تعداد نسخه های ژن فیتوئن دساچوراز گیاهچه های سرخدار نسبت به شاهد باعث شود. نتایج همچنین نشان داد که وکتور ویروسی چه در حالتی که دارای ژن بوده و چه در حالت خالی تاثیری بر هیچ کدامیک از پارامترهای فیزیولوژیکی رشد نداشته اند. در گیاهان تزریق شده با وکتورهای ویروسی نسبت به گیاهان شاهد (که آگروباکتریوم بدون وکتور را دریافت کرده بودند. شاخص هایی فیزیولوژیکی چون وزن تر و خشک ساقه و ریشه، طول ریشه و ارتفاع ساقه و تعداد انشعابات ریشه تغییر معنی داری پیدا نکرده بودند. نتایج مربوط به آنالیز میزان تاکسوئیدهای موجود در گیاهان سرخدار با استفاده از روش کروماتوکرافی با کارایی بالا (hplc) نشان داد که سطوح این ترکیبات در گیاهچه های تزریق با وکتورهای ویروسی نسبت به شاهد تفاوت معنی داری دارد. بطور کلی در برگ های گیاهان تزریق شده با وکتورهای trv (دارای ژن یا بدون ژن) میزان تاکسوئیدهایی چون تاکسول، باکاتین iii و 10-داستیل باکاتین نسبت به گیاهان شاهد به طرز معنی داری بیشتر بود. نتایج همچنین نشان داد که روش تزریق وکتورهای ویروسی نیز بر میزان تاکسوئیدهای تولید شده در گیاهان سرخدار تاثیر داشته است، بطوریکه گیاهانی که وکتورهای ویروسی با روش m1 به آن های تزریق شده بود نسبت به گیاهان تزریق شده با روش m2، تاکسوئیدهای بیشتری داشتند. از جنبه بیوتکنولوژی، دانستن این واقعیت که ویروس ها قادر به تحریک گیاهان سرخدار به ساخت بیشتر ترکیباتی چون تاکسول هستند می تواند در آینده به کاربرد این موجودات بعنوان الیسیتور در کشت سوسپانسیون برای افزایش تولید این ترکیبات منجر شود.