جداسازی، استخراج و تخلیص آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز(oph)از منبع باکتریایی و تثبیت آن روی بیوپلیمر کیتوزان

ترکیبات ارگانوفسفره، گروهی از ترکیبات استر، آمید یا مشتقات تیولی فسفریک سمی هستند که بطور گسترده در کنترل حشرات و آفات بکار می‎روند. پس‎مانده‎های ترکیبات ارگانوفسفره در آبهای زیرزمینی، منابع آبی و غذاها، پس از جذب در بدن، باعث غیرفعال شدن آنزیم استیل کولین استراز و ایجاد عوارضی در موجود زنده می کنند. آنزیم ارگانوفسفرهیدرولاز (oph) یا فسفوتری استراز (pte)، آنزیم تجزیه کننده طیف وسیعی از ترکیبات ارگانوفسفره می باشد. این آنزیم که برای اولین بار از فلاووباکتریوم جدا شد، متالوآنزیمی همودایمر با وزن مولکولی kd 72 و 336 واحد اسید آمینه و موجود در غشای سیتوپلاسمی است که عضوی از سوپر فامیلی آمیدوهیدرولاز بوده و از یون دو ظرفیتی برای حمله نوکلئوفیلی استفاده می کند. میکروارگانیسم‎های موجود در خاک اعم از باکتریها و قارچها، که توانایی تجزیه و استفاده از ترکیبات ارگانوفسفره بعنوان منبع c و n و p برای رشد را دارند، حاوی این آنزیم می باشند. این میکروارگانیسم‎ها قادر به هیدرولیز پیوندهای p-o ، p-f ، p-cn و p-s موجود در نوروتوکسینهای ارگانوفسفره می باشند. تثبیت آنزیم oph روی سطوح مختلف، یکی از موثرترین روش ها جهت توسعه سم زدایی و حسگرها می باشد. کیتوزان بعنوان بیو پلیمری که شامل گروههای آمین و هیدروکسیل واکنش دهنده بوده و نیز به علت وجود گروههای آمین بعنوان پلی الکترولیت کاتیونیک، از اهمیت خاصی برخوردار بوده وکاربرد فراوانی را بویژه در زمینه تثبیت پیدا کرده است. در این مطالعه باکتری تجزیه کننده سموم ارگانوفسفره از خاکهای کشاورزی تیمار شده با این سموم جدا و سپس آنزیم oph از آن تخلیص شد. مراحل تخلیص شامل سونیکیت، استفاده از تریتون x100، رسوب گذاری با سولفات آمونیوم و کروماتوگرافی تعویض یونی با deae بود. آنزیم تخلیص شده روی بیدهای کیتوزان تثبیت شد. در این تثبیت از گلوتارآلدهید بعنوان کراس لینکر استفاده گردید. اتصال آنزیم به بیدهای کیتوزان با سیستم طیف سنجی مادون قرمز و سنجش فعالیت آنزیمی تایید شد. فعالیت آنزیم آزاد و تثبیت شده در دماهای 25-37-45-60-70و 80 درجه سانتیگراد برای یافتن دمای بهینه بررسی شد. همچنین پایداری حرارتی آنزیم آزاد و تثبیت شده در دماهای مذکور ارزیابی گردید. ph بهینه و پایداری آنزیم آزاد و تثبیت شده در ph های 12-2 مورد بررسی قرار گرفت. پارامترهای کینیتیکیkm و vmax نیز از معادله لینویور- برک محاسبه شد. اثر یون های sds ، licl ، fecl3، mgcl2 ، nacl ، cobalt ، zncl ،edta روی آنزیم آزاد بررسی گردید. ارزیابی استفاده از آنزیم آزاد و تثبیت شده در تشخیص سم در سرم های تیمار شده با سم پاروکسون نیز انجام شد. پایداری ذخیره ای آنزیم آزاد و تثبیت شده در دمای 4 درجه سانتیگراد و در نهایت ارزیابی قابلیت استفاده دوباره از آنزیم تثبیت شده نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که ph بهینه برای فعالیت آنزیم ارگانوفسفرهیدرولاز آزاد و تثبیت شده 8=ph بوده و کمترین فعالیت آنزیمی نمونه های ذکر شده در ph اسیدی مشاهده شد. بررسی بهینه دما نشان داد که دمای بهینه برای آنزیم آزاد و تثبیت شده به ترتیب 37 و 45 درجه سانتیگراد می باشد. در بررسی پارامترهای کینیتیکی مشخص شد که km و vmax آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز تثبیت شده در مقایسه با آنزیم آزاد به ترتیب کمتر و زیادتر می شود. نتایج بررسی میزان پایداری ذخیره ای آنزیم حاکی از آن بود که تثبیت آنزیم باعث افزایش پایداری ذخیره ای آن شده است. از طرف دیگر ارزیابی استفاده دوباره از آنزیم تثبیت شده نشان داد که حداقل 3 بار می توان از آنزیم تثبیت شده استفاده کرد بدون اینکه فعالیت آن کاهش یابد. بررسی کارآیی آنزیم آزاد و تثبیت شده در تشخیص سم در سرم ، نشان داد که تشخیص با آنزیم تثبیت شده، سریعتر وبا خطای کمتری همراه است. نتایج حاصل از این پروژه حاکی از نقش مثبت تثبیت آنزیم در افزایش فعالیت و پایداری آنزیم می باشد؛ بطوریکه روش مذکور جهت تثبیت آنزیم های مشابه روی بیدهای کیتوزان بسیار مناسب بوده و بیوکونژوگه سنتز شده جهت کاربردهای مختلف پیشنهاد می شود.