ردیابی و شناسایی نوروویروس در آب های سطحی مشهد با استفاده از روش rt-pcr و douplex pcr

چکیده هدف: آب های سطحی مشهد در معرض خطر آلودگی به نورویروس ها هستند. یکی از راه های شایع انتقال این ویروس ها انتقال از طریق آب می باشد که انتقال این ویروس ها به انسان سبب شیوع بیماری هایی مانند گاستروانتریتیس می شود. روش کار: در این تحقیق در زمان های مختلف از آب سطحی سدهای طرق و کارده چندین بار نمونه گیری صورت گرفت. پس از فیلتراسیون و تغلیظ اولیه نمونه ها از سه کیت تجاری تجاری1 -trizol 2tripure- 3 bioneer -برای بدست آوردن حداکثر rna کل ویروسی استفاده شد. سپس کمیت rna استخراج شده با دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتراندازه گیری شد و در ادامه واکنش رونویسی معکوس با استفاده از آنزیم m-mlv برای ساخت cdna کل بر اساس روش استاندارد صورت گرفت. مقادیر cdna تعیین و با همسان سازی غلظت آنها از واکنش زنجیره ای پلیمراز با تکثیر قطعات 203و514 جفت بازی از جایگاه های ژنی کپسید و rna پلیمراز به منظور ردیابی و شناسایی نور ویروس استفاده گردید. سپس به منظور شناسایی و اثبات حضور نوروویروس واکنش زنجیره ای پلیمراز به روش آشیانه ای صورت گرفت و محصولات pcr حاصل بر روی ژل آگارز 6/1 درصد الکتروفورز گردید. آزمون حساسیت به منظور بررسی سنجش میزان حساسیت این روش با استفاده از شش سری متفاوت رقت cdna نمونه کنترل مثبت 5/1، 10/1، 20/1، 100/1، 1000/1 و 10000/1 برای کپسید و هچمین رقت های مشابه برای نمونه کنترل مثبت پلیمراز انجام شد. نتایج و بحث: نتایج این تحقیق وجود سه نمونه آلودگی آب های سطحی به نوروویروس 2 انسانی و دو نمونه آلودگی آب به نوروویروس 1 انسانی را ثابت نمود، همچنین با نتایج آزمون حساسیت مشخص گردید که با روش های بکاربرده شده در این تحقیق تنها در رقت 5/1، 10/1، 20/ 1 cdna کل، برای کپسید و5/1 برای پلیمراز می توان نورویروس ها را در آب های سطحی و سایر نمونه های آلوده ردیابی نمود. نتیجه گیری: بطور کلی این تحقیق نشان داد که روش های مولکولی مانند rt-pcr و douplex pcr که دراین تحقیق برای اولین بار در ایران جهت تشخیص نوروروس ها در آب های سطحی سدهای طرق و کارده بکاربرده شده است، روشی مناسب برای ردیابی این ویروس ها در آب های سطحی می باشد. از آب سدهای طرق و کارده برای تامین برخی از نیازهای آبی شهر مشهد استفاده می شود و از آنجا که احتمال وجود نور ویروس دراین آب ها زیاد می باشد لذا با توجه به احتمال شیوع گسترده بیماری های نورو ویروسی مسئولین ذیربط باید توجه بیشتری به حذف این نوع آلودگی ویروسی از آب های سطحی نمایند.