مطالعه بیان cdna فاکتور9 انسانی در سلولهای سرطانی شده کبدی(hepg2) با استفاده از پروموترهای کایمریک غیر اختصاصی و اختصاصی کبدی

بیماری هموفیلی b، بصورت مغلوب وابسته به جنس به ارث می رسد و فراوانی آن در جمعیت مردان 30000/1 می باشد. فقدان و یا نقص در عملکرد پروتئین فاکتور9 در پلاسما منجر به این بیماری می گردد. سلولهای کبدی به عنوان جایگاه اصلی تولید فاکتور 9 انعقادی، میزبان مناسبی جهت بررسی بیان فاکتور 9 قلمداد می شوند. جهت بیان اختصاصی در سلولهای کبدی، به توالی های تنظیمی اختصاصی کبدی نیاز است. در این ارتباط تلفیقی از توالی افزاینده آلدولاز b کبدی رت با پروموتر اختصاصی کبدی آلفا-1 آنتی تریپسین و با پروموتر cmv جهت ساخت پلاسمیدهای غیر ویروسی به منظور بیان فاکتور 9 در سلولهای کبدی انجام پذیرفت. سپس کارائی پلاسمیدهای ساخته شده در سلولهای مقاوم hepg2 توسط آزمون الایزا بر روی محیط کشت و درون سلولهای نوترکیب و آزمون نیمه کمی rt-pcr بررسی گردید. توالی افزاینده آلدولازb ، عملکرد هر دو پروموتر اختصاصی کبدی و غیر اختصاصی را به ترتیب 8 و 3 برابر بهبود بخشید. بالاترین بیان فاکتور 9 از تلفیق توالی افزاینده آلدولاز b با پروموتر ویروسی cmv حاصل گردید که بالاترین تجمع فاکتور9 در درون سلول نیز از این سازه ژنی بدست آمد. بنابراین، توالی افزاینده آلدولاز کبدی به عنوان یک توالی تنظیمی سیس مناسب جهت بیان پروتئین های مختلف در هپاتوسیتها پیشنهاد می گردد. با توجه به نقش و عملکرد اینترون ها در مراحل پس از رونویسی، در نسل دوم پلاسمیدهای نوترکیب، اینترون های 1، 2 بتا گلوبین انسانی بطور جداگانه و بطور همزمان در موقعیت مشابه در cdna فاکتور9 قرار داده شدند. همچنین، جهت افزایش کارائی ترجمه، توالی کوزاک قبل از شروع کدون ترجمه در سازه های ژنی ساخته شده قرار داده شد. استفاده از اینترون های بتا گلوبین در cdna فاکتور9 بیان این پروتئین را کاهش داد. این کاهش بیان را می توان با احتمال، به اسپلایسینگ نادرست اینترون های بتا گلوبین در cdna فاکتور9 نسبت داد.