تجزیه و تحلیل ملکولی جدایه های فایتوپلاسمایی گروه s rrnai16 (aster yellows) در منطقه مرکزی ایران

چکیده گروه فایتوپلاسمایی aster yellows (candidatus phytoplasma asteris) عامل بیماریهای مهمی در میزبان های مختلف گیاهی مانند سبزیجات، گیاهان زراعی، گلهای زینتی و درختان بوده و خسارت فراوانی را به این محصولات در سراسر جهان وارد می کند. تاکنون زیر گروه های مختلفی برای این گروه فایتوپلاسمایی معرفی شده است که مبنای تفاوت آنها اختلاف در توالی نوکلئوتیدی بعضی از ژنها در این زیر گروه ها می باشد. طی سال های اخیر، ca. phytoplasma asteris به عنوان عامل بیماری فایتوپلاسمایی برخی گیاهان از بعضی استان های ایران مانند استانهای واقع در منطقه مرکزی گزارش شده است. هدف اصلی این پژوهش، تشخیص تفاوت های ژنتیکی جدایه های ca. phytoplasma asteris ردیابی شده در این ناحیه و تعیین زیر گروههای آن در نظر گرفته شد. به این منظور در سال 1387 نمونه های متنوعی از گیاهان مبتلا به بیماریهای فایتوپلاسمایی از استانهای اصفهان، چهارمحال و بختیاری، یزد و مرکزی جمع آوری گردید. علایم مشاهده شده در این گیاهان به صورت زردی، ارغوانی شدن برگ، فیلودی، جاروی جادوگر، تولید ساقه گل دهنده و تغییر شکل در اندام های مختلف گیاه بود. از رگبرگ ها و دمبرگ های این نمونه با استفاده از روش موری و تامسون استخراج dna انجام گرفت. برای ردیابی فایتوپلاسما از واکنش pcr دور اول با جفت آغازگر عمومی فایتوپلاسما p1/p7 استفاده شد و در ادامه کار تکنیک nested-pcr برای تکثیر قسمت داخلی ناحیه s rrna 23-16 با استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r16r2 به کار رفت. با مشاهده قطعات dna تکثیر شده توسط واکنش های pcr روی ژل آگاروز tbe 2/1% الکتروفورز، معلوم گردیدکه فقط تعداد محدودی از نمونه ها در pcr دور اول تکثیر قابل مشاهده در ژل دارند، ولی استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r16r2 در nested-pcr بعد از pcr دور اول با جفت آغازگر p1/p7 ،در اکثر نمونه ها منجر به تولید یک قطعه ~bp 1240 شد. در هیچ کدام از نمونه های سالم در واکنش های pcr و nested-pcr باندی تکثیر نشد. تجزیه و تحلیل برش آنزیمی قطعات dna تکثیر یافته از ناحیه داخلی ژن s rrna23-16 ( جفت آغازگر r16f2n/r16r2 ) با استفاده از آنزیم hhai(cfoi) نشان داد که اکثر نمونه ها مبتلا به گروه فایتوپلاسمایی ca. phytoplasma solani می باشند و برخی دیگر نیز به دو گروه فایتوپلاسمایی ca. phytoplasma trifolii و ca. phytoplasma phoenicium تعلق دارند. در بین نمونه های مزبور، 21 نمونه متعلق به ca. phytoplasma asteris تشخیص داده شدند که این تعداد از میزبان های متفاوت زینتی، زراعی، سبزی و علفهای هرز و از استانهای مختلف جمع آوری شده بودند. در هیچ یک از نمونه های جمع آوری شده از استان چهارمحال و بختیاری این گروه فایتوپلاسمایی ردیابی نشد. برای تعیین زیر گروه های احتمالی ca. phytoplasma asteris، از آنالیز pcr-rflp ناحیه ژن rp تکثیر یافته با جفت آغازگر rp(i)f1a/rp(i)r1a و به کارگیری سه آنزیم alui، msei، tsp509i استفاده گردید. براساس مقایسه الگوی برش آنزیمی نمونه ها، جدایه ها به دو گروه تقسیم شدندکه تعدادی از آن ها به عنوان نماینده هایی از هر گروه تعیین توالی نوکلئوتیدی گردیدند. مقایسه توالی های نوکلئوتیدی این جدایه ها با توالی جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که اکثر جدایه های مورد بررسی در این تحقیق متعلق به زیر گروه (rp-b) هستند و فقط پنج نمونه در زیر گروه rp-l قرار گرفتند که در پیاز، دان سیاه و هویج ردیابی شده بودند . شناسایی هر دوزیرگروه b و l در مناطق مرکزی و از میزبان های مختلف می تواند بیانگر این مطلب باشد که در بین زیر گروه ها محدودیت میزبانی وجود ندارد. با توجه به گزارش فایتوپلاسمای دیگر همراه با ca. phytoplasma asteris از مناطق مرکزی ایران، احتمالاً ناقل مشترکی در گسترش این فایتوپلاسماها نقش دارد. کلمات کلیدی: فایتوپلاسما، pcr-rflp، جدایه، aster yellows