طراحی و ساخت قطعه رقابتگر با روش soe-pcr به منظور کمی سازی جمعیت باکتری شکمبه ای بوتیریویبریو فیبری سالونس

در این مطالعه، بر اساس منطقه 16s rdna باکتری شکمبه ای هضم کننده سلولز، بوتیریویبریو فیبری سالونس، یک روش واکنش زنجیره ای پلیمراز رقابتی (cpcr) بهینه سازی شد. آغازگرهای اختصاصی این باکتری برای تکثیر یک قطعه 213 جفت نوکلئوتیدی از ناحیه 16s rdna (dna هدف) از منابع انتخاب گردید. برای تولید قطعه رقابتگر همولوگ با قطعه هدف، دو آغازگر داخلی، که هر کدام حامل حدود 30 نوکلئوتید در انتهای ?5 خود بودند (به صورتی که بتوانند تکثیر شوند و مکمل یکدیگر باشند) طراحی شدند و یک واکنش soe-pcr شامل سه واکنش مجزای pcr با استفاده از جفت آغازگرهای متفاوت انجام شد. قطعه حاصل از این واکنش ها در نهایت علاوه بر توالی نوکلئوتیدی قطعه هدف دارای 50 نوکلئوتید بیشتر می باشد. جهت افزایش بیشتر صحت pcr رقابتی و همچنین استفاده های آتی از این قطعه و سهولت تعیین دقیق تعداد نسخه های آن این قطعه در داخل یک ناقل پلاسمیدی (ta) و با استفاده از باکتری e. coli به عنوان میزبان، همسانه سازی شد و صحت توالی همسانه سازی شده بوسیله هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب مورد تأیید قرار گرفت. واکنش pcr رقابتی با استفاده از مقادیر مشخصی از dna پلاسمیدی به عنوان رقابتگر بهینه سازی شد و نتایج به دست آمده با استفاده از نرم افزار image j تجزیه و تحلیل شدند. نتایج نشان دادند روش استفاده شده به خوبی قابلیت تشخیص و تعیین کمی مقادیر باکتری بوتیریویبریو فیبری سالونس را در نمونه های گرفته شده از شکمبه را دارا می باشد.