بررسی الگوی بیان ژنهای bcl-2, p53, bax و survivin پس از پیوند سلول های بنیادی اسپرماتوگونیال در بیضه موش مدل کریپتور کیدیسم یک طرفه

افزایش درجه حرارت بیضه به دنبال نهان¬بیضه¬ای منجر به اختلال در اسپرماتوژنز و ناباروری می¬گردد. در تحقیق حاضر ضمن ارزیابی اثرات طولانی مدت حرارت در مدل نهان¬بیضه¬ای یک طرفه و دو طرفه بر پارامتر¬های اسپرم و ساختمان بیضه موش، بیان ژنهای دخیل در ایجاد مرگ سلولی برنامه ریزی شده در مدل نهان بیضه¬ای و راه¬های درمان کاهش سلول¬های ژرم در لوله¬¬های منی¬زا بعد از قرار گرفتن در معرض حرارت بررسی گردید. به منظور ایجاد مدل نهان بیضه¬ای یک طرفه و دو طرفه در موش نا بالغ (سن زیر دو ماه) پس از بیهوشی با ایجاد برش کوچکی در پوست ناحیه فوقانی شکم توده چربی بالای بیضه به پریتونیوم دوخته شد. 2، 4، 6و 8 هفته بعد از جراحی بیضه¬ها برداشته شده ارزیابی ساختار بیضه و پارامترهای اسپرم در اپیدیدیم آنها صورت گرفت. ارزیابی بیان mrna و پروتئین ژنهای آپوپتوتیک bcl-2 ,p53 , survivin وbax در زمان¬های مختلف پس از حرارت دیدن بیضه¬های کریپتورکید با روش¬های rt-pcr نیمه کمی و ایمونوهیستوشیمی اجرا گردید. در مرحله بعد سلولهای اسپرماتوگونی و سرتولی از بیضه موش مدل نهان بیضه¬ای دو¬طرفه با استفاده از مراحل هضم آنزیمی، pnaو dsa لکتین جدا سازی شدند. ماهیت سلول ها علاوه بر ریخت¬شناسی از طریق نشانگرهای اختصاصی oct-4 در سلول های اسپرماتوگونی کلونی¬ها و ویمنتین در سلول سرتولی تأیید شد. تعلیق سلولی حاوی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی به صورت هم کشت با سلول سرتولی به مدت سه هفته کشت داده شد. ارزیابی کلونی(اندازه گیری قطر و تعداد کلونی) در پایان هر هفته و با میکروسکوپ نوری انجام گرفت. در انتها دو روش درمانی مورد بررسی قرار گرفت. در گروه پیوندی سلول های اسپرماتوگونی حاصل از کشت با brdu نشاندار شد و با غلظت 105 به لوله های منی¬زای بیضه چپ موش مدل نهان بیضه¬ای 3 ماه پس از جراحی بالا بردن پیوند شده، سپس بیضه به کیسه بیضه برگردانده شد. در گروه دیگر بیضه موش مدل 2 ماه پس از جراحی بالا بردن به کیسه بیضه برگردانده شد. 8 هفته بعد از درمان بیضه¬ها از نظر ساختاری، فراساختاری، بیان ژنها و پروتئین¬های آپوپتوتیک مورد بررسی قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل آماری به کمک آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تکمیلی tukey انجام شد. مطالعات ما نشان داد که در تمام گروه¬های آزمایشی اسپرماتوژنز متوقف شده، وزن بیضه¬ها و قطر لوله¬های منی¬زاکاهش یافته و تغییرات مذکور به صورت معنی¬داری در بیضه¬های گروه دو طرفه در مقایسه با گروه یک طرفه و کنترل کاهش نشان داد. اسپرماتوسیت¬ها و اسپرماتید¬ها مهم¬ترین گروه های سلول های ژرم بودند که در تمام گروه ها دچار آپوپتوزیس شدند. اطلاعات rt-pcr نیمه کمی موید تغییر بیان ژن¬های bax p53, و bcl-2 در بیضه نهان شده به صورت وابسته به زمان بود. بیان survivin 225 و 140 در گروه دو طرفه در مقایسه با گروه یک طرفه و کنترل کاهش یافته، در حالی که بیان survivin 332 در گروه¬های آزمایشی پایین بود. تغییرات مذکور در گروه¬های دو طرفه در مقایسه با یک طرفه مشهود¬تر بود. بررسی¬های ایمونو¬هیستوشیمی مویدافزایش شدت بیان پروتئین¬های p53 و bax در سلول¬های باقیمانده در بیضه کریپتورکید و کاهش بیان پروتئین¬های bcl-2 و survivin به خصوص در گروه دو طرفه بود. پیوند سلول¬های بنیادی به لوله¬های منی¬زای موش¬های گیرنده دارای تخریب شدید لوله¬ای بعد از ایجاد نهان بیضه¬ای در مقایسه با گروه برگردانده شده به کیسه بیضه موفقیت آمیز بود. پس از پیوند کلونی زایی سلول¬ها در لوله¬ها مشاهده شده، تعداد اسپرماتوگونیا و اسپرماتوسیت¬ها به حد طبیعی برگشته اما اسپرماتوژنز در مراحل پیشرفته¬تر اندکی بهبود یافت. در کل افزایش دما منجر به کاهش تمام پارامترهای بررسی شده به جز تعداد سلول های اسپرماتوگونیال گردید به این دلیل مدل مذکور برای غنی سازی سلول¬های بنیادی اسپرماتوگونیال مناسب می باشد. مشاهدات حاصل از روش¬های rt-pcr نیمه¬کمی و ایمونو¬هیستوشیمی نشان¬دهنده دخالت مسیر¬های مختلف مولکولی در آپوپتوزیس ایجاد شده در مدل نهان¬بیضه¬ای بود. برگشت نسبی فرآیند اسپرماتوژنز در سطح اسپرماتوزوا پس از پیوند ممکن است ناشی از اختلال در خون رسانی و آسیب عصبی و همچنین به خاطر عدم باز سازی طبیعی کیسه سروزی اطراف بیضه به علت ایجاد چسبندگی به دنبال جراحی باشد.