طراحی روشی جدید با نام (cma (chimeric primer–mediated amplification برای تکثیر dna در دمای ثابت

متدهای تکثیر اسیدهای نوکلئیک، نقش مهمی در بیولوژی مولکولی دارند. در این بین تعدادی از تکنیک ها به صورت تک دمایی و بدون نیاز به سیکل حرارتی ارائه شده اند که علاوه بر داشتن سرعت بالا در تکثیر، به سادگی قابل انجام هستند و در تشخیص های مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند. تکنیک حاضر، با عنوان cma ، از جمله تکنیک هایی به شمار می رود که قادر است، باعث تکثیر dna در دمای ثابت گردد. دو نوع آنزیم در این روش استفاده می گردد که عبارتند از rbst large fragment dna polymerase و آنزیم tli rnase h. پرایمرهای مورد استفاده در این روش، بصورت کایمریک می باشند و هر پرایمر از سه قسمت تشکیل یافته است. در ناحیه 5 آن، یک قطعه 5-4 نوکلئوتیدی dna قرار می گیرد، قطعه rna به طول 5-4 نوکلئوتید، در وسط و نهایتا در قسمت 3 آن، قطعه ای از جنس dna به طول تقریبی 20-17 نوکلئوتید قرار دارد. در اثر اتصال پرایمر به تک رشته الگو، در ناحیه rna پرایمر، یک هیبرید rna/dna ایجاد می شود. این هیبرید، مورد شناسائی و حمله آنزیم rnase h قرار می گیرد و روی رشتــه rna برشهــایی ایجاد می کند. بدین ترتیب، در محـل برش،oh 3 آزاد ایجاد می شود. آنزیم dna پلی مراز، این شکاف ها را مورد شناسایی قرار می دهد و از ناحیه شکاف شروع به فعالیت پلی مریزاسیون می کند. یکی از خواص آنزیم این است که در هنگام پیشروی، اگر به ناحیه دو رشته ای برخورد کند، رشته متصل به رشته الگو را کنار می زند. با کنار زدن رشته، یک تک رشته ایجاد می شود. قسمت dna ناحیه 3 پرایمر backward، به این تک رشته، اتصال می یابد و توسط آنزیم dna پلی مراز گسترش می یابد. انتهای 3 رشته الکو نیز توسط آنزیم گسترش می یابد و ناحیه مکمل پرایمر ساخته می شود. بدین ترتیب یک دورشته ای ایجاد می گردد که در ناحیه ای از طول خود دارای هیبرید rna/dna است و مجددا مورد حمله آنزیم rnase h قرار می گیرد. این تکنیک قادر است، در مدت کمتر از یک ساعت باعث تکثیر dna الگو گردد. دمای واکنش در محدوده بین 60 الی 65 درجه سانتی گراد است ولی آنزیم ها تا دمای 70 درجه سانتی گراد را نیز تحمل می کنند و تا این حد از دما، تکثیر انجام پذیر است. از جمله خصوصیات دیگر این تکنیک، توانایی تکثیر dna ژنومی است و میزان تکثیر، با افزایش غلظت پرایمرها افزایش می یابد. همچنین، در این تکنیک، الگوی باندها روی ژل، به صورت چند باندی است که ماحصلاتصال قطعات تکثیر شده و ایجاد قطعات بزرگتراست. ما احتمال می دهیم این حالت، در اثر پدیده template switching آنزیم dna پلی مراز انجام می گیرد.