همسانه‌سازی و انتقال آنزیم T7RNAپلیمراز باکتریوفاژ T7 به توتون

کشاورزی مولکولی به تولید پروتئین­های دارویی و آنزیم­های صنعتی توسط گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک اطلاق می­شود. آنزیم T7RNA پلیمراز یکی از مهمترین آنزیم­هاست که به طور وسیعی در زمینه­های مختلف بیوتکنولوژی و زیست­شناسی سلولی و مولکولی، از قبیل سنتز و مطالعه ساختار و عملکرد RNA ها در شرایط آزمایشگاهی استفاده می­ شود. RNAهای سنتز شده در شرایط آزمایشگاهی در هیبریداسیون، ریزآرایه، آزمایشات   RNAiو  RNAآنتی­ سنس کاربرد دارد. این آنزیم همچنین در سیستم­های بیانی وابسته به پیشبر و خاتمه دهنده T7 کاربرد فراوان دارد. آنزیم T7RNA پلیمراز یک آنزیم باکتریوفاژی بوده و فعالیت اصلی آن در سیتوپلاسم می­باشد. تحقیق حاضر جهت همسانه­ سازی، انتقال ژن آنزیم T7RNA پلیمراز به هسته­ سلولهای یوکاریوتی و تولید آن در گیاه توتون انجام گرفت. آغازگرهای مناسب از روی توالی ژن T7RNA پلیمراز به همراه توالی­های مناسب برای آنزیم­های برشی، طراحی و ژن T7RNA پلیمراز مورد نظر پس از جداسازی در ناقل بیانیpCAMBIA1304 همسانه­سازی شد. به منظور اطمینان از همسانه­سازی، سازه تهیه شده با استفاده از PCR، هضم آنزیمی و توالی­یابی بررسی شده و همردیفی آن در بانک اطلاعاتی اسیدهای نوکلئیک تأیید گردید. سپس، سازه نوترکیب به کمک سویه LB4404 آگروباکتریوم به گیاهان توتون منتقل و گیاهان تراریخته بر روی محیط­های کشت انتخابی حاوی آنتی­ بیوتیک­های هیگرومایسین و سفوتاکسیم، باززا شدند. حضور و بیان ژن T7RNA پلیمراز در گیاهان تراریخته با روشهای PCR وRT- PCR  تأیید شد.