طراحی، ساخت و بیان پروتئین فیوژن tat - bont/a (1- 448) کلستریدیوم بوتولینیوم و ارزیابی جذب سطحی آن در رده سلولی be(2)- c و موش balb/c

توکسین بوتولینیوم تیپ a که توسط یک باکتری گرم مثبت بی هوازی تولید کنند? اسپور به نام کلاستریدیوم بوتولینیوم تولید می شود، با فعالیت آنزیمی مانع از رها شدن وزیکول حاوی نوروترنسمیتر تحریکی استیل کولین، در محل اتصال عصب- عضله شده و بنابراین به طور موقت از انتقال پیام عصبی و انقباض عضله جلوگیری می کند. امروزه، از این ویژگی توکسین در پزشکی برای درمان بعضی نقایص ماهیچه ای استفاده می شود. هدف این مطالعه تولید زنجیر? سبک توکسین بوتولینیوم تیپ a [bont/a (1- 448)] به صورت فیوژن با پپتید tat از خانواد? پپتیدهای نفوذ کننده به سلول (cell penetrating peptides) یا cpp و بررسی میزان جذب توکسین از سطح پوست و ارزیابی عملکرد آن بود. به طور خلاصه، ابتدا توالی dna زنجیر? سبک توکسین بوتولینیوم تیپ a که بخش کاتالیتیک توکسین است پس از برش با آنزیم های محدودگر مناسب، درون ناقل بیانی پروکاریوت، pet28a، که حاوی دنباله هیستیدین و توالی ژن مربوط به پپتید tat است، کلون گردید. بعد از ترانسفر ناقل بیانی میزبان باکتریایی و القای بیان با iptg، تأیید بیان به روش وسترن بلاتینگ با کمک آنتی بادی anti-his صورت گرفت. بعد از تخلیص،ورود پروتئین کایمریک تولید شده به کشت سلولی به روش وسترن بلاتینگ بررسی گردید. جهت بررسی فعالیت پروتئین نوترکیب به صورت in vitro، پروتئین snap-25 به عنوان سوبسترا استفاده شده و قطعات حاصل از هضم آنزیمی، با روش hplc جداسازی شدند. سر انجام، جذب سطحی آن از پوست حیوان آزمایشگاهی با کمک ایمونوهیستوشیمی مورد ارزیابی قرار گرفت.