کلونینگ و بیان آنزیم پیرازین آمیداز جهش یافته و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی و بیو فیزیکی آن

پیرازین آمید یکی از مهم ترین داروها برای درمان بیماری سل می باشد که موثرترین عامل در برابر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نهفته بوده و استفاده از آن برای درمان بیماری سل به همراه ایزونیازید و ریفامپین می تواند دوره درمان را از نه ماه به شش ماه کاهش دهد. نیکوتین آمیداز/پیرازین آمیداز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در فعال سازی پیش داروی پیرازین آمید توسط تبدیل آن به پیرازینوئیک اسید نقش دارد. با این وجود ظهور سویه های مقاوم به پیرازین آمید مشکل مهم سلامت جهانی می باشد. مکانیسم عمده ی مقاومت پیرازین آمیدی، جهش هایی در ژن pnca (ژن رمزکننده ی پیرازین آمیداز) فرض می شود. با این حال چگونگی تاثیر این جهش ها بر فعالیت و ساختار پیرازین آمیداز نا مشخص است. در این تحقیق ما پیرازین آمیداز نوع وحشی و جهش یافته های آن را کلون و بیان گردید. فعالیت آنزیم با استفاده از یک روش مبتنی بر تست واین سنجیده شد. پارامتر های سینتیکی vmax و km برای هرکدام از آنها محاسبه و به منظور درک نحوه ی تاثیر این جهش ها بر فعالیت آنزیمی، ساختار آنها توسط همولوژی مدلینگ مدل سازی شد. هم چنین تاثیر فلزات مختلف بر فعالیت و پایداری پیرازین آمیداز نوع وحشی و جهش یافته های آن بررسی شد. نتایج ما نشان داد که فعالیت آنزیمی با توجه به موقعیت و نوع جهش تغییر می کند. جهش یافته های l151s وa143t/t168a/ e173k تا حدودی فعالیت آنزیمی را حفظ ولی جهش یافته ی t160p هیچ گونه فعالیتی نشان نداد. مشخص شد برخی از فلزات می توانند فعالیت جهش یافته ها را افزایش داده و به منظور افزایش حساسیت تست های پیرازین آمیدی مورد استفاده قرار گیرند.