بررسی امکان تشخیص باکتری های متعلق به گونه salmonella enterica زیرگونه enterica با روش pcr والکتروفورز با شیب دمایی (ttge)

salmonella، یکی از عمده ترین عوامل مسبب بیماری های ناشی از غذا می باشد که باعث بیماری های شدیدی به خصوص در کودکان، افراد پیر و بیمارانی که سیستم ایمنی آنها تضعیف گردیده، می شود. روش های تشخیصی مبتنی بر کشت و سرولوژیکی علاوه بر زمانبر بودن، به دلیل اختصاصیت و حساسیت پایین، کاربرد محدودی دارند؛ لذا جهت تضمین سلامت غذا، دستیابی به روش های دقیق تر و سریع تر برای تشخیص salmonella مورد نیاز می باشد. در این مطالعه به منظور تشخیص باکتری های مختلف گونه salmonella enterica زیرگونه enterica روش pcr و الکتروفورز با شیب دمایی (pcr-ttge) بهینه سازی شده است. روش ttge قادر به تفکیک توالی هایی که حتی در یک جفت باز متفاوت هستند، می باشد، باکتریهای استاندارد salmonella و non-salmonella بر روی محیط tsb (tryptic soy broth)در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت رشد داده شده و dna ژنومی آنها استخراج گردید. جهت مشاهده ناحیه های ذوب توالی منتخب، از نرم افزار meltingeny استفاده شد. بررسی همردیفی توالی های مورد نظر (یک ناحیه 214 جفت بازی کدکننده اندونوکلئاز غیراختصاصی) در چهار سروتایپ متعلق به این زیرگونه، تفاوت هایی را بین آنها نشان داد؛ لذا برای استفاده در این روش مناسب می باشد. در خصوص اختصاصیت آغازگرهای مربوطه، پس از بهینه سازی شرایط pcr، در ارتباط با باکتری های non-salmonella باندی مشاهده نگردید. حساسیت pcr در نمونه غذایی تلقیح شده با باکتری salmonella typhimurium، بعد از 18 ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد، cfu/ml 1 تعیین شد. چند نمونه کالباس مرغ نیز جهت تشخیص باکتری های زیرگونه salmonella با دو روش کشت و pcr مورد بررسی قرار گرفتند و آلودگی با این باکتری ها مشاهده نشد. در پایان، بهینه سازی شرایط ttge جهت تفکیک dna باکتری های استاندارد، صورت گرفت. با به کارگیری شیب دمایی 5/62 تا 5/67 درجه سانتیگراد، میزان ramp دمایی c/h?1 و الکتروفورز در ولتاژ ثابت v 130 و مدت زمان 5 ساعت، بهترین حالت تفکیک مشاهده گردید. نتایج نشان داد که نواحی تکثیر یافته حاصل از چهار باکتری salmonella در ژل آگارز 2/1% در یک سطح قرار داشته اما با ایجاد شیب دمایی مناسب، این محصولات با طول یکسان و توالی متفاوت، از یکدیگر قابل تفکیک بوده و موقعیت های متفاوتی را بر روی ژل به خود اختصاص دادند. نمونه های تلقیحی نیز به طور صحیح همسطح با باکتری های مربوطه قرار گرفتند. بنابراین پس از بهینه سازی روش pcr-ttge و تعیین الگوی باندی مشخص برای باکتری های استانداردsalmonella ، می توان به صورت مستقیم باکتری های مختلف این زیرگونه را در مواد غذایی مورد بررسی قرار داد. (ytrptic soy tsb بر روی محیط non-salmonella و salmonella . باکتریهای استاندارد ژنومی آنها استخراج dna در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت رشد داده شده و broth) استفاده شد. بررسی meltingeny گردید. جهت مشاهده ناحیههای ذوب توالی منتخب، از نرمافزار همردیفی توالیهای مورد نظر (یک ناحیه 214 جفت بازی کدکننده اندونوکلئاز غیراختصاصی) در چهار سروتایپ متعلق به این زیرگونه، تفاوتهایی را بین آنها نشان داد؛ لذا برای استفاده در این روش مناسب می- در ارتباط با باکتریهای ،pcr باشد. در خصوص اختصاصیت آغازگرهای مربوطه، پس از بهینهسازی شرایط در نمونه غذایی تلقیح شده با باکتری pcr باندی مشاهده نگردید. حساسیت non-salmonella بعد از 18 ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد، ،salmonella typhimurium با salmonella 1 تعیین شد. چند نمونه کالباس مرغ نیز جهت تشخیص باکتریهای زیرگونه cfu/ml مورد بررسی قرار گرفتند و آلودگی با این باکتریها مشاهده نشد. در پایان، بهینه- pcr دو روش کشت و باکتریهای استاندارد، صورت گرفت. با بهکارگیری شیب دمایی dna جهت تفکیک ttge سازی شرایط c/h دمایی ramp 67 درجه سانتیگراد، میزان / 62/5 تا 5 ? 130 و مدت زمان v 1 و الکتروفورز در ولتاژ ثابت 5 ساعت، بهترین حالت تفکیک مشاهده گردید. نتایج نشان داد که نواحی تکثیر یافته حاصل از چهار 1% در یک سطح قرار داشته اما با ایجاد شیب دمایی مناسب، این / در ژل آگارز 2 salmonella باکتری محصولات با طول یکسان و توالی متفاوت، از یکدیگر قابل تفکیک بوده و موقعیتهای متفاوتی را بر روی ژل به خود اختصاص دادند. نمونههای تلقیحی نیز به طور صحیح همسطح با باکتریهای مربوطه قرار گرفتند. و تعیین الگوی باندی مشخص برای باکتریهای pcr-ttge بنابراین پس از بهینهسازی روش میتوان به صورت مستقیم باکتریهای مختلف این زیرگونه را در مواد غذایی مورد ،salmonella استاندارد بررسی قرار داد.