مقایسه روش های ردیابی armillaria mellea عامل پوسیدگی آرمیلاریایی ریشه و طوقه درختان در خاک و گیاه با استفاده از روش های سنتی و آغازگرهای اختصاصی

بیماری پوسیدگی آرمیلاریایی ریشه و طوقه، از بیماری های مهم گیاهان چوبی است که انتشار جهانی دارد و خسارت قابل توجهی را به دامنه وسیعی از درختان باغی، جنگلی و فضای سبز وارد می سازد. علایم هوایی بیماری شامل رنگ پریدگی، خشکیدگی و ریزش برگ ها و زوال تدریجی گیاه و نشانه های عامل بیماری شامل تشکیل میسلیوم سفید رنگ بادبزنی زیر پوست درخت، ریزومورف های سیاه رنگ و کلاهک های دسته جمعی در محل طوقه گیاه می باشد. قارچ عامل بیماری، متعلق به شاخه بازیدیومیکوتا و جنس armillaria می باشد که در میان گونه های مختلف آن، a. mellea از دیرباز به دلیل بیماری زایی روی درختان، شناخته شده است. با توجه به اهمیت بیماری، ردیابی بیمارگر از خاک باغ ها، نهالستان ها و فضای سبز شهری می تواند در پایه ریزی یک طرح مدیریتی جهت پیشگیری و کاهش خسارت بیماری نقش مهمی داشته باشد. تاکنون روش های متعددی برای ردیابی قارچ های خاک زاد استفاده شده است که شامل استفاده از محیط کشت نیمه انتخابی، تله گذاری، روش های سرولوژیکی و روش های مولکولی می باشند. این تحقیق، به منظور دستیابی به یک روش ردیابی اختصاصی، حساس و سریع بیمارگر از خاک و ریشه، انجام گرفت. سیزده جدایه متعلق به جنس armillaria از طریق کشت کلاهک های قارچ رشد یافته در اطراف طوقه درختان آلوده به دست آمد و با تکثیر توسط جفت آغازگر عمومی its1 / its4 در واکنش اولیه و جفت آغازگر اختصاصی ar1 / ar2 در واکنش ثانویه طی آزمون nested pcr تایید گردید. جهت تشخیص گونه a. mellea از آغازگرهای اختصاصی گونه با نام های its4 / amel3 استفاده و نه جدایه متعلق به a. mellea شناسایی شد. در مرحله بعد، مایه تلقیح بیمارگر برای جدایه های 295c و a2 که به عنوان a. mellea شناسایی شده بودند، تهیه و به میزان سه درصد به خاک، تلقیح گردید و سپس ردیابی بیمارگر با استفاده از سه روش محیط کشت، تله گذاری وnested pcr به طور همزمان، انجام گرفت. محیط کشت نیمه انتخابی، توانایی ردیابی بیمارگر را در درازمدت نداشت. در روش تله گذاری از قلمه های ریشه دار شده شمعدانی استفاده شد که جهت ردیابی بیمارگر از خاک به مدت طولانی نیاز داشت. در روش nested pcr ردیابی بیمارگر به صورت متناوب و به مدت شش ماه برای جدایه 295c و سه ماه برای جدایه a2 با موفقیت انجام گرفت. به منظور ارزیابی دقت روش ردیابی مورد استفاده، محصول nested pcr به طور مستقیم توالی یابی شد. نتایج توالی یابی، شباهت 99% جدایه اصفهان را با جدایه a. mellea ثبت شده در genbank نشان داد. سپس امکان ردیابی بیمارگر در نمونه های چوب و خاک جمع آوری شده از تعدادی باغ و نهالستان، با استفاده از روش محیط کشت و nested pcr بررسی شد که تنها روش nested pcr در ردیابی بیمارگر کارآمد تشخیص داده شد. همچنین حساسیت این روش در ردیابی رقت های مختلف dna از خاک، نشان داد که روش مزبور توانایی ردیابی dna بیمارگر را تا غلظت یک pg/?l دارد. بر اساس نتایج به دست آمده، روش nested pcr به دلیل حساسیت، اختصاصی بودن و سرعت بالا به عنوان مناسب ترین روش جهت ردیابی a. mellea از نمونه های خاک و ریشه، تشخیص داده شد.