Biokatalytische Ganzzellproduktion des Sesquiterpens Presilphiperfolan‐8β‐ol in stoffwechseloptimierten <i>Escherichia coli</i>

Die fermentative Ganzzellproduktion in Escherichia coli ermöglicht die Produktion komplexer Naturstoffe, wie Terpene, aus einfachen, günstigen und nachhaltigen C-Quellen. Ziel der Arbeit war es, einen solchen Prozess zur Synthese von Presilphiperfolan-8β-ol (PSP) zu entwickeln. Der Biosyntheseweg dieses tricyclischen Sesquiterpenalkohols konnte erfolgreich E. eingebracht werden. resultierende Multiplasmid-Stamm ist Lage, vivo über den Mevalonat-Weg Farnesylpyrophosphat bilden, welches dann durch Sesquiterpencyclase BcBOT2 PSP umgesetzt wird. Das überwiegend das Kulturmedium sekretiert Produkt via GC-MS identifiziert GC-FID quantifiziert entwickelte Stamm produzierte bei 20 °C 48 h 10 mg L−1 direkt C-Quelle Glycerin. Fermentative whole-cell production offers the option of producing complex natural products such as terpenes from simple, inexpensive, and sustainable carbon sources. The aim this study was to develop a process for synthesis presilphiperfolan-8β-ol (PSP). biosynthetic pathway tricyclic sesquiterpene alcohol successfully introduced into coli. resulting multi-plasmid strain able produce farnesyl pyrophosphate mevalonate pathway, which then converted by cyclase BcBOT2. product, is mainly secreted culture medium, identified quantified GC-FID. constructed produced at directly feedstock. Terpene setzen sich Isopreneinheiten zusammen bilden mit ihren bisher mehr als 80 000 bekannten Verbindungen größte Klasse sekundärer Naturstoffe 1. Für diesen Facettenreichtum sind vor allem sogenannten Terpencyclasen (TCn) verantwortlich. Mit Hilfe dieser Enzyme kann einfachen linearen diphosphorylierten Terpenvorläufern eine sehr große Bandbreite an (oligo)cyclischen hervorgehen. Hierfür durchlaufen Vorläufer innerhalb des aktiven Zentrums Enzyms nach Abspaltung Pyrophosphatgruppe Reaktionskaskade Cyclisierungen, Umlagerungen, De- Reprotonierungen 2. In soll Fokus hauptsächlich auf Enzym Presilphiperfolan-8β-ol-Synthase (BcBOT2) gelegt Hierbei handelt es um Sequiterpencyclase (STC), welche Cyclisierung ausgehend vom C15-Terpenvorläufer (FPP) 1 zum Sesquiterpenalkohol 2 katalysiert (s. Abb. 1) 3-5. STC wurde erstmals dem Pilz Botrytis cinerea isoliert, welcher Hauptverursacher Grauschimmelkrankheit verantwortlich Nutzpflanzen Obst Gemüse befallen 6 damit für weitreichende ökonomische Folgen Ernteertrag sorgt 7, 8. diesem Fall sondert Vielzahl Stoffwechselprodukten ab, dessen Pathogenität sind. Ein bekanntes Phytotoxin hierfür Sesquiterpen Botrydial 3, Zwischenprodukt hervorgeht 9. Hinblick Biosynthese Botrydial, gezeigt werden, dass BcBOT2-Gen BOT-Genclusters wiederfindet 10. Neben codierenden BcBOT2-Gen, Zwischenproduktes PSP, codieren Gene BcBot1, BcBot3, BcBot4 jeweils drei verschiedene P450 Monooxygenasen BcBot5 Acyltransferase 3. BcBOT6 dient Transkriptionsfaktor Regulation Expression. BcBOT7 Dehydrogenase Bezug Struktur Größe, setzt einem Bündel α-Helices besitzt Proteingröße 47,43 kDa. Innerhalb befinden Position 141 285 ein aspartatreiches DDQFD-Motiv N(S/T)(E/D)-Triade bzw. NDVLSYRKD-Motiv Diese konservierten Bereiche charakteristisch I TCn, Metallcluster Mg2+ Co-Faktor angewiesen Spaltung initiieren Zusätzlich Bildung auch unnatürliche FPP-Derivate umzusetzen, zusätzlich Heteroatome enthalten 11. So unnatürlicher Sesquiterpenoide synthetisiert Auch gezielte Mutagenese bereits durchgeführt, wodurch weitere bicyclische tricyclische Sesquiterpenalkohole erhalten wurden nun, stoffwechseloptimierten exprimieren, In-vivo-Biosynthese einer Kohlenstoffquelle ermöglichen. Somit Sesquiterpenalkoholen fermentativen Ganzzellproduktionssystem möglich ist. Dabei bietet solches Produktionssystem einige Vorteile gegenüber Biokatalyse isolierten Enzymen. zelleigenen Cofaktor-Regenerationssystemen werden kostspielige Aufreinigungsprozesse eingespart 12. Weiterhin stellt Zelle geschützte Umgebung dar, weil pH Osmolarität natürliche Homöostase reguliert 13. Sofern Zellen wird, wird Rückhalt downstream Prozessierung vereinfacht 14. Gerade mehrstufigen Synthesen, Sesquiterpenen, bieten ganzzellkatalytische Produktionssysteme großes Potential. Durch molekularbiologischen Methoden können viele heterolog Organismen Saccharomyces cerevisiae exprimiert 15. Fortschritte Systembiologie kombiniert „omics”-Technologien bioinformatischen liefern ständig neue postulierte Stoffwechselwege Organismus Art Baukasten-Prinzip 14, 16, 17. Erkenntnissen „metabolic engineering” so verschiedenste Produkte entwickelt früheren Arbeiten hat verschiedenen (–)-Patchoulol 18, β-Caryophyllen 19, α-Humulen (–)-α-Bisabolol 21, 22. Um Sesquiterpenen erreichen, muss zelluläre Vorläufers FPP Substrat sichergestellt sein. verfügt Stoffwechselweg Herstellung FPP, Methylerythritolphosphatweg (MEP-Weg), Überexpression 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-synthase (DXS) erhöhten intrazellulären FPP-Konzentration führt 23, 24. wichtiger Schritt Terpenen Ganzzellsystem Co-Expression Mevalonat-Wegs (MEV-Weg) Mikroorganismen Keasling Mitarbeitern. MEP-Wegs umgangen weitaus höhere erreicht Verfügung steht 25. Eine Übersicht aller verwendeten entstandenen Stämme Plasmide Tab. aufgeführt. Plasmid pBbA5c-MevT(CO)-T1-MBIS(CO, ispA) (pMev; Addgene #35152) freundlicherweise im Klonierungsstamm DH10B Jay Taek Soon Lee diese gestellt 25, 26. pET28a(+)-BcBOT2 (pBcBOT2) lag BL21(DE3) vor, beschrieben 27. QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen, Niederlande) Übernachtkulturen entsprechenden isoliert. Identität analytischen Restriktionsverdau nachgewiesen Abbn. S1 S2 Supporting Information). erhaltende Plasmid-DNA bis Verwendung –20 gelagert. Plasmid-Bezeichnung Name Beschreibung (Replikationsursprung, Promotor, Antibiotikaresistenz Gene) Ref. pMev pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, p15A, PlacUV5 Ptrc, ChloramphenicolR, beinhaltet Mevalonatweg: AtoB, HMGS, tHMGR, MK, PMK, PMD, Idi IspA. pBcBOT2 pBR322, PT7, KanamycinR, Gen Presilphiperfolan-8β-ol-Synthase: Bezeichnung coli_Mev_DH10B coli_Mev_BL21 [*] coli_BcBOT2 coli_PSPgz Plasmiden co-transformiert. Einbringen erzeugt. Transformationen Hitzeschockmethode durchgeführt 28 chemisch kompetente Novagen (Merck, Deutschland) verwendet. Stammerhalt transformierten Lysogeny Broth (LB) Agarplatten, Antibiotika (Kanamycin 50 µg oder Chloramphenicol 34 L−1), ausplattiert sowie Glycerin-Kryokulturen –80 Alle Kultivierungen erfolgten Schüttelkolben Schikanen luftdurchlässiger Membran Deckel Rotationsinkubator. Vorkulturen mL LB, versetzt Einzelkolonie LB-Agarplatte inokuliert. 37 150 Upm Nacht inkubiert. Hauptkulturen 100 Komplexmediums Terrific (TB), Volumen Inokulation gewählt, Startzelldichte (OD600) 0,1 rel. AU wurde. Bis Induktion Proteinexpression Kulturen geschah Erreichen Zelldichte 0,8–1,0 Zugabe 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Danach folgte PSP-Produktion Temperatur 16 Upm. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), gaschromatografischen Analytik Bestimmung Biotrockenmasse (BTM) 6, 12, 24 Proben entnommen. Als Vergleich entstehenden Umsetzung betrachtet. Dafür Terpencyclase Produktionsstamm coli_BcBOT2, entsprechend Abschn. 2.2, überexprimiert. Da N-terminalen Histidin-Tag verfügt, Aufreinigung mittels Affinitätschromatografie Nickel-Nitrilotriessigsäure-Säule (Ni-NTA) möglich. Herstellung, enzymatische 11, In-vitro-Reaktion Maßstab TRIS-Puffer (50 mM, 8.0) DTT (5 mM) durchgeführt. Es µM 5 MgCl2 0,03 g isoliertem gereinigtem 25 30 min umgesetzt. Extraktion terpenoiden stets n-Hexan da dies geeignetes Lösemittel erwiesen Nachweis Quantifizierung Zentrifugation × 4 abgetrennt. Überstand abgenommen verbliebende, unlöslich Zellbestandteile eines Spritzenvorfilter (0,2 µm Porengröße, Sartorius, entfernt. gemäß 2,0 normiert Kulturbrühe (10 min, °C) abgetrennt medienfreie Pellet 300 µL Extraktionspuffer (40 TRIS-HCl, NaCl, 7,5) suspendiert. Anschließend Ultraschallsonde (Bandelin, aufgeschlossen (Amplitude 40 %, s angeschaltet, 8 Pause, Gesamtzeit min). Zelltrümmer unlösliche (20 anschließend µm) zellfreie Medium, zell- Lysat In-vitro-Reaktionsansatz Glasgefäße überführt überschichtet. Gemisch kräftig geschüttelt Phasen 6000 Raumtemperatur) getrennt. organische Phase gaschromatografische Analyse SDS-PAGE ebenfalls OD600 pelletiert verworfen. Zellaufschluss enzymatisch mithilfe BugBuster® Protein-Extraktionsreagenz (Merk, angeben Herstellers Lösliche Proteinfraktionen Im befindet lösliche Proteinfraktion („soluble fraction”, SF) („insoluble IF) dar. gleichen ddH2O Beide 4x Laemmlie Ladepuffer 95 erhitzt. Analysen %igen SDS-Polyacrylamidgelen Auftrennung Proteine erfolgte konstanter Spannung variierenden Stromstärke. Färbung Gele kolloidales Coomassie. quantitative extrahierten enzymatischen vitro Reaktionsansatzes Gaschromatografie Flammenionisationsdetektor (GC-FID) GC-2030 plus System (Shimadzu, Japan). Von allen splitless Autosampler injiziert. Injektor-Temperatur betrug 240 Trägergas Wasserstoff Zur Zebron™ ZB-WAXPlus Säule (30 m Länge, 0,25 mm Innendurchmesser, Filmdicke) (Phenomenex, USA) eingesetzt. Folgendes Ofenprogramm verwendet: Starttemperatur s; Erhitzen 200 Heizrate min−1; halten; Endtemperatur 230 halten min. Detektortemperatur °C. Geraniolkonzentration Kalibrationsreihe Geraniolstandards berechnet S4). PSP-Standards nicht erhältlich sind, β-Cedrol Standard verwendet S5). Identifizierung per Massenspektrometrie (GC-MS) DB-5MS UI (Agilent Technologies, Helium weiteren gewählten Parameter nachfolgend aufgeführt: Injektion: on column; 60 °C; 3 min; Ionisation: Elektronenspray; MS-Quad: Scanbereich 33 m/z m/z. herzustellende Lage sein, Glycerin synthetisieren. zwei Vektoren eingebracht. Vektor pBbA5c-MevT(CO)-T1-MBIS(Co, (pMev) enthält genetische Information Mevalonatwegs inklusive FPP-Synthase IspA, sodass MEP-Weg ausreichend bilden. Auf (pBcBOT) genetischen Informationen BcBOT2, Anschluss gewünschten umsetzen 2). Expression codon-optimiert. synthetische Operons geregelt, zentrale korrekter Konzentration vorliegen. Mevalonat Acetyl-CoA, unter Kontrolle lacUV5-Promotors „top-Operon” S2A). Über „bottom-Operons”, aktiveren trc-Promotors befinden, zweiten befindet, unterliegt T7-Promotors S1A). Folglich lässt zuständigen (IPTG) gezielt induzieren. konnten E.coli co-transformiert unterschiedliche (KanR, CmR) vorweisen, entsprechende Selektionsdruck LB-Agarplatten, beide enthielten, Kolonien co-transformierten Stamms wachsen. nachfolgenden beiden sicherzustellen, Plasmid-Verlust kommt. Kultivierung erhaltenden Stammes Komplexmedium (TB) Dieses nährstoffreiche Medium Biomasseproduktion fördert andern Ganzzellproduktionsstämmen erhöhte Terpenproduktion beobachten Dem TB-Medium zugesetzt, β-Carotin bessere Glucose hatte 29. Desweitern Wachstums- Produktionsphase möglichst optimale Wachstumsbedingungen gewährleisten, Induktionszelldichte gewählt. Nach herabgesetzt, unlöslichen Aggregaten, sogenannter Einschlusskörperchen (inclusion bodies), rekombinanten vermeiden. Versuchen Patchoulol außerdem höchste Produkttiter °erreicht 18. Anhand evaluiert, wobei getrennt wurden. theoretisches Molekulargewicht kDa aufweist, SDS-Gelen deutlich erkennen 3) 30. Sowohl Produktionstemperatur inclusion bodies vermieden Während Anteil löslichen Verlauf kontinuierlich abnimmt, am größten 3B). liegt fast vollständig 3C). wenn Aggregaten Aktivität Umständen ganz verloren geht, sie doch häufig geringer beobachtet 31. Deshalb eher Cytosol lokalisierte Wildtypen aktiv löslich vorliegenden davon ausgegangen Konformation vorliegt 32. geringen Mengen Dies Regulierung Mev-Gene trc UV5 geringere Transkriptionsmengen T7-Promotor, BcBOT2-Expression erfolgreichen Co-Transformation somit nur Produktbildung geschehen. Produktes überprüft Eventuelle terpenoide Produkte, Gazzellproduktionsstamm gebildet zellfreien lysierten Fermentation extrahiert. Negativkontrollen dienten Mediums Fermetation coli_Mev_BL21, induzierten coli_PSPgz. Fermemtation enzymatischer zeigt Chromatogramme Ganzzellproduktionsstamms Negativkontrollen. Peaks (1 2) höherer Intensität auszumachen 4). In-vitro-Enzymreaktion zeigen dagegen Peak Bei Retentionszeit 10,5 Nebenprodukt, entstanden Nebenprodukt kommerziell erhältlichen Standards Geraniol bestätigt stimmt gaschromatografich aufgetrennten Kultivierungsporben überein (Daten aufgeführt). Außerdem NIST-Datenbank Fragmentierungsmuster Anlytik S12 S13). acyclisches Monoterpen entsteht C10-Terpenvorläufer Gernaylpyrophosphat (GPP) 33. Geraniolbidlung exprimierte FFP-Synthase IspA zurückzuführen. GPP 34. durch, nativ vorkommende, Dephosphorylasen 35. 12,3 erwartete PSP. konnnte anderem In-vitro-Enzymtests In-vitro-Enzymtest extrahierte weist fermentativ hergestellte stimmen hergestellten 5). Referenz Pinedo et al. herangezogen hergestelltes authentische PSP-Probe NMR identifiziert. Molpeak m/z-Wert 222 Massenspektren Weitere übereinstimmende 207, 189, 175, 161, 149, 125, 69 55. induziertem detektiert (Peak 2, s. anzunehmen, Basalexpression eingebrachten Stoffwechselenzyme Insbesondere lacUV5 T7-Polymerase DE3 Stämmen kontrolliert, Grundexpression 36. T7 Polymerase Transkription zuständig ist, Promotor coli_BcBOT, keine Demzufolge endergon gebildete FPP-Menge ausreichend, Fehlen Jedoch erwarten, MEV-Weg Überschuss Akkumulation Farnesol 37, 38. coli_Mev_BL21-Kultivierung Zudem zeigte gehemmtes Wachstum anderen Kontrollen S3), Toxizität anreichernden erklärt 39. untersuchen, Nebenproduktes ändert, Des Weiteren Einfluss Geraniol-Produktion untersucht Verhältnis zwischen bestimmt. Wachstumskurven PSP-Titer Zellen. Wie maximale schneller erreicht. sich, Menge erst ab Kultivierungsdauer unterscheidet. steigt mehr, während PSP-Menge (9,2 L−1) Dass weiter steigen ausgeschlossen Zum stationären gezeigt, Degradation Verdunstung Terpenmenge längerer wieder abnimmt 40, 41. erwähnt, geht Aktivitätsverlust einher 3). Nichtsdestotrotz lieferte höheren Produkt-Titer. Biomasse zurückgeführt 7B PSP-Ausbeute bezogen Biotrockenmasse. PSP-Ausbeuten Produktionstemperaturen unterscheiden signifikant. weiterer Faktor PSP-Konzentration beurteilen, wo neben Lysaten 7 grafisch dargestellt. Ergebnisse zeigen, Teil akkumuliert. (∼0,8 gemessen. Durchschnitt etwa 94 % Demnach Großteil sekretiert, aufwändigere In-situ-Produktabtrennung entfällt. gefunden wurde, anfällt, bestimmt 7C). angestrebte Produkt, wichtige Ressourcen verbraucht. Daher sollte Geraniol-Konzentration gering ermittelte 0,4 ermittelt. Vergleich: Zeitpunkt 5,7 14-mal höher 7A). geringste Unterschied beobachten. Hier immerhin noch 7-mal höher. scheint ähnlichen Geraniol-Titer haben, PSP-Titer. an. Allerdings beobachten, abnimmt. anhand Geraniol-Ausbeute 7D) sehen hohe Flüchtigkeit Geraniols zurückzuführen schon konnte, reichert kaum stoffwechseloptimierte erstellt Dieser exprimierten Mevalonat-Stoffwechselwegs synthetisieren umzusetzen. sekretiert. erzielt. Produktkonzentration -ausbeute weiteres Entwicklungspotential. Induktionsparametern, komplexe definierte Medien unterschiedlichen Kohlenstoffquellen angepasst 2-Phasensystems, überschichtet könnte Produktausbeute steigern. Weiterführende Artikel (Supporting Information) finden Sie DOI: https://doi.org/10.1002/cite.202200115. technische Unterstützung Martina Weiß Martin Pähler gedankt Ulrich Krings Institut Lebensmittelchemie Analytik. nds. MWK Förderung wissenschaftlichen Rahmen ABA-Projektes (FKZ: ZN3822) Mitteln VW-Vorab. Open Access Veröffentlichung organisiert Projekt DEAL. Acetoacetyl-CoA-Thiolase Geranylpyrophosphat 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Synthase Isopentenylpyrophosphat-Isomerase insoluble fraction (unlösliche Proteinfraktion) broth Mevalonat-Kinase Mevalonatdiphosphat-Decarboxylase Phosphomevalonat-Kinase relative absorption units (relative Absorptionseinheiten) Sodium dodecyl Polyacrylamidgelelektrophorese soluble (lösliche 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA-Reduktase Please note: publisher not responsible content or functionality any supporting information supplied authors. Any queries (other than missing content) should be directed corresponding author article.