Aufreinigung von Nano‐ und Submikronpartikeln durch präparative Gelelektrophorese

Die präparative Gelelektrophorese ermöglicht die Auftrennung von Nano- und Submikronpartikeln auf Basis ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität. Es wird gezeigt, dass eine Trennung der Partikel nicht nur nach Partikelgröße, sondern auch Oberflächenladung bzw. Oberflächenchemie Morphologie möglich ist. Während diese Methode analog zum Einsatz in Biotechnologie bislang kleine Mengen beschränkt ist, werden Möglichkeiten für Steigerung des Partikeldurchsatzes sowie kontinuierliche aufgezeigt. The preparative gel electrophoresis enables the separation of nano- and submicron particles based on different electrophoretic mobilities. In this contribution, we show that a fractionation not only by particle size is possible, but also surface charge/chemistry morphology. Whilst method, analogy to its application biotechnology, yet restricted small quantities, possibilities for an increase throughput as well continuous are shown. Viele Anwendungen dem Gebiet Nanotechnologie erfordern den Nanopartikeln mit einheitlichen Eigenschaften 1, 2. Beispielsweise zeichnen sich Halbleiter-Nanopartikel, sog. Quantum dots, durch größenabhängige Bandlücke aus, so optische monodisperse Nanopartikel (NP) einer sehr engen Größenverteilung benötigt 3. Zudem ermöglichen Partikelgrößenverteilungen (PGV) z. B. bei Selbstanordnungsprozessen Ausbildung kristalliner Überstrukturen höchster Präzision 4. analoger Weise bieten weitere Vorteile hohen Einheitlichkeit, beispielsweise ist scheibchenförmige gegenüber Stäbchen schnellere zelluläre Aufnahme berichtet worden 5. Auch einheitliche Oberflächenchemie, etwa definierte Anzahl bindungsfähigen funktionellen Gruppen Partikeloberfläche, erscheinen Biomedizin großem Vorteil 6. Ein hoher Grad Homogenität Partikeleigenschaften kann jedoch jedes Material direkt Synthese erreicht werden, insbesondere Herstellung größerem Maßstab. Größen im µm-Bereich oder oberhalb üblicherweise post-synthetische durchgeführt wird, um gewünschten Fraktionen zu erhalten, deren Durchführung nanoskalige (im Größenbereich 1–100 nm) Submikronpartikel (darunter 100 nm–1 µm verstanden) oftmals problematisch. ein klassischer Siebprozess aufgrund Oberflächenkräfte starken Agglomerationsneigung dieser Sieb benötigten Maschenweite < 1 realisierbar. Aus diesem Grund zunehmend Partikeltechnik neuartige Methoden etabliert, homogenere trennen, wobei häufig Techniken aus anderen Fachdisziplinen adaptiert werden. Größenausschlusschromatographie 7 Fraktionierung NP gemäß Partikelgröße -form. Dabei Probe stationäre poröse Phase, Partikelpackung einem Gel bestehen kann, geführt. kleineren diffundieren dabei stärker Porenstrukturen hinein, was verlängerten Retentionszeit somit größenabhängigen führt. Magnetische können magnetische Chromatographiesäule geleitet wo sie Partikelgrößen unterschiedlich starke Anziehungskräfte stationären Säulenmaterial erfahren über ungleiche Verweilzeiten Trennsäule auftrennen 8. Des Weiteren mikrofluidische Kanäle Kanälen definierten Strömungen (Asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung, AFFFF) besonderen Formen (multi-orifice flow fractionation, MOFF Serpentinenkanal), Hindernisse Kanal (deterministic lateral displacement, DLD), akustische Wellen Anlegen eines inhomogenen elektrischen Feldes (Dielektrophorese) herbeigeführt 9-11. Trotz Potenzials Partikelfraktionierung weisen immer noch einige Herausforderungen industriellen Betrieb auf, wie Xie et al. Übersichtsartikel 9 berichten. jeweilige Feldkraft typischerweise proportional Partikelvolumen, Nanometerbereich einen dazu führt, Kräfte Widerstands- Zähigkeitskräften deutlich kleiner Zum sind ebenso Unterschiede äußerst gering, folglich Unschärfen Eine alternative Methode, ebenfalls Lebenswissenschaften entlehnt stellt elektrophoretische dar. Nach ersten Demonstration Anwendung zur Blutserum seine vier Hauptbestandteile α-, β-, γ-Globulin Albumin Tiselius 12 entwickelte Elektrophorese rasch breit eingesetzten Methode. Insbesondere Agarose- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) analytische Detektion Makromolekülen DNA, Proteinen bspw. SARS-CoV-2 Viren 13-15 genutzt. Im Gegensatz wurde partikulärer Proben einzelnen Arbeiten untersucht wenig verstanden. Grundlegend partikuläre das Spannung Wanderung angeregt, einzelne Fraktionen, dann als Banden vorliegen, bewirken kann. Das besteht dreidimensionalen vernetzten Polymerstruktur, Pufferlösung vorliegt. Da Engstellen Struktur, sogenannten Maschen, Submikronbereich besitzen, hohe Diffusivität stark eingeschränkt, ausgeschalteter liegen immobilisiert vor. Dies verhindert Rückvermischung mittels Zentrifugation auftreten prinzipiell unterschiedliche Arten Hydrogelen verwendet empfiehlt Agarosegelen geringen Feststoffkonzentrationen großen partikulären Proben. Feld Mobilität μE beschrieben, welche u.a. -form Maschenweite, genutzten Puffer Feldstärke abhängig 16-19. Sobald zwei aufweisen, hochgenaue erzielt Partikelmischung basierend Vielzahl Parametern – neben Größe dies mehrere getrennt Idealerweise erscheint sogar mehrdimensionale möglich, gleichzeitig mehreren Fraktion großer erhalten jeweils nochmals geladener untergliedert sind. solch komplexe Gegenstand aktuellen Forschung. beeinflusst naturgemäß Partikel. Theorie Ogston starres angesehen Migration Flüssigkeitskanälen stattfinden muss 20, es essenziell hinreichendes Potenzial Partikeloberfläche Abhängigkeit pH-Werts verwendeten Elektrolytlösung isoelektrischen Punktes Partikelmaterials müssen kolloidale Stabilität Agglomeration wird. Gels dessen gezielt werden; angewandten maßgeblich verwendete Agarosekonzentration einstellbar. führen Konzentrationen dichten Netzwerk Maschenweiten, Erkenntnissen Maaloum 18 AFM-Messungen flüssigen Medium Gauß-Verteilung folgen. Zusätzlich gibt weiteren Einflussfaktoren, Vorstufe Gels, Temperaturhistorie Alterung 21, 22. Jedoch Bestimmung durchschnittlichen trivial ermittelte Wert hängt Messmethode ab 14, 23. kürzlich erschienenen Veröffentlichung 23 vergleichen wir ermittelten mittleren Maschenweiten unterschiedlicher Messmethoden, Rasterkraftmikroskopie (AFM) 18, Kernspinresonanz (NMR) 24 anhand Ferguson-Diagrammen. Für Letztere zunächst Migrationsgeschwindigkeit DNA-Fragmenten bekannter reine bestimmt danach Gelkonzentration ermittelt, Fragmente halben Rate wandern. Anhand erweiterten Ogston-Theorie Gyrationsradius mittlere angenommen 25. Der Vergleich zeigt eindeutig, Messmethoden verschiedenen Werten „wahren“ gar Verteilung schwierig zumal Agarosegele Partikeltrennung üblichen Agarosekonzentrationen geringe Entnahme Elektrophoresekammer aufweisen. Partikeln Literatur metallische da Nachverfolgung plasmonischen genutzt können, Morphologien verschiedenartige Farben besitzen 26. solche Trennaufgaben niedrigen Feststoffanteilen (Feststoffgehalte Gew.-%), Partikelwanderung komplett inhibieren. Gelkonzentrationen unter 0,15 Gew.-% keinen homogenen Gelen mehr, vereinzelten Gelakkumulationen, reinen maximalen ca. 300 nm wandern können. Beitrag SiO2-Partikeln Modellsysteme oxidische Praxisrelevanz Goldnanopartikeln untersucht. sowohl Oberflächeneigenschaften vielfältige Anwendungsmöglichkeiten praktische Trennprobleme aufzeigt. Durch systematische Untersuchungen konnten Verhältnisses Gelmaschenweite Wanderungsmechanismen identifiziert Sind wesentlich bewegen uneingeschränkten Gel. Fall behindert rein ihres Zetapotenzials. Ist ähnlich eingeschränkte beobachtet, verlangsamt verhindert. Beide Mechanismen ausgenutzt binäre Mischungen Größe, trennen. Wenngleich Probenmengen erlaubt, konnte Erhöhung zehnfache Menge Aufreinigung größerer wäre erstrebenswert, allerdings konventionellen eindimensionalen keine effektive erlaubt. letzten Abschnitt daher Möglichkeit kontinuierlichen überlagerten Feldern Gradientengel Stufengel vorgestellt. Abb. 1a bildet schematisch ab, Elektroden besteht, alle Teile kontaktiert enthält Taschen, vorgelegt (hier gestrichelte Linie). anliegt, fangen gegensätzlich geladenen Elektrode bewegen. Wanderungsgeschwindigkeit diversen -ladung individuellen Mobilitäten auftrennen. Versuchsaufbau 1b samt Peripherie, wozu Spannungsquelle, Kamera Lichtquelle Beleuchtung gehören. 1c sieht man Nahaufnahme Kammer Pfeile angedeuteten Pt-Elektroden. Außerdem Seitenwände Kamm, flüssige Gellösung einerseits Umschließen hindern; andererseits damit Geltaschen Entfernen Kamms erzeugt. 1d Blick werfen erkennt SiO2-NP, gestreute Licht helle wahrnehmbar Striche Hintergrund wurden schwarzes Papier Abstand mm gedruckt, Wanderungsdistanzen bestimmen Um Agarosegel extrahieren, „Pool“ lassen. 27 beschrieben horizontal Hälften geteilt. separate transferiert nah platziert, dort kleines Becken entsteht. Danach weit aufgefüllt, Elektroden, aber bedeckt Wenn Anschluss angelegt Pufferlösung, Pipette abgenommen Zur 0,5-gewichtsprozentigen Agarosegels 10×TBE (Tris, Borat, EDTA)-Pufferlösung (Rotiphorese, Carl Roth, 0,89 M) entionisiertem Wasser 0,5×TBE (berechnete Ionenstärke = 0,0179 mol L−1) verdünnt. nächsten Schritt 0,25 g Agarosepulver (UltraPure, Thermo Fischer Scientific) 50 mL verdünnten Erlenmeyerkolben gegeben mäßigem Rühren Stopfen 90 °C erhitzt. Diese Temperatur 10 min lang gehalten, homogene Flüssigkeit 55 reduziert. niedrigere wurde, (MINIeasy, Gelmaße: 8 × 0,6 cm3) gegossen weiterer Abkühlung polymerisierte. 30 vorsichtig Puffers pipettiert, Stromfluss Kathode Anode gewährleisten während kühlen. Erst kurz vor Versuch Kamm entfernt. Stufengels erfolgte Arbeit einfachste Form Gradientengels. zuerst niedriger (0,15 Gew.-%) gesamte polymerisieren gelassen (ca. min). Teil entfernt höher konzentrierten (1,20 aufgegossen, optisch trüber erscheint. polymerisierte Gel, Abschn. 2.3 wieder zusätzlichem übergossen genommen sphärischer Siliziumdioxid-Partikel Stöbersynthese 28, Ethanol (p.a.), Ammoniumhydroxid-Lösung (NH4OH, 28–30 %) Tetraethylorthosilikat (TEOS, 98 gemischt Nacht (12 h) Raumtemperatur mäßig (400 rpm) gerührt Verdopplung erreichen, einfach NH4OH verdoppelt, NH4OH-Konzentration steuerbar ursprünglich transparente Lösung milchig trüb, Bildung SiO2-Partikel deutet. Anschließend Suspension zentrifugiert, Überstand abgegossen erhaltene Niederschlag Rührplatte redispergiert. Dieser Waschvorgang insgesamt drei Mal wiederholt. Schlussendlich Suspensionen (x50,3 50–300 erzeugt mindestens Stunden sedimentierten Feststoffgehalt aufwiesen. Gold-NP seeded-growth-Synthese realisiert 16. Zunächst Gold(III)-chlorid-Hydrat (HAuCl4 · 3 H2O, ≥ 49 %), Hexadecyltrimethylammoniumbromid CTAB (≥ 99 Hexadecyltrimethylammoniumchlorid CTAC 25 % H2O) Natriumborhydrid NaBH4 Ascorbinsäure gemischt, Au-Keime 5 29. Folgenden kontrolliertes Wachstum Keime sphärischen Au-NP definierter Zugabe Spritzenpumpe erreicht. stäbchenförmiger dieselbe Keimdispersion genutzt, Natriumoleat (90 Silbernitrat Salzsäurelösung (12,1 Wachsen Aspektverhältnissen ermöglichte 30. Partikelgrößenverteilung dynamischer Lichtstreuung (bei 633 nm, Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., U.K.) 173°-Rückstreumodus bestimmt. Dafür musste verdünnt Zählrate zwischen 150–350 kcps (kilo counts per second) gewährleisten. Jede volumengewichteten PGV Messungen x50,3-Wert gemittelten volumetrischen hydrodynamischen Durchmesser entspricht. dynamische Viskosität η, relative Permittivität Mediums εr,m 80), Vakuums ε0 (ε0 8,85 10−12 F m−1) Henry-Funktion f(κα) Debye-Länge 1/κ Partikelradius α abhängig, κα > Smoluchowski-Zetapotenzial (f(κα) 1,5) wurde. SiO2-NP systematisch untersuchen, Dispersionen mittlerer Stöber-Methode synthetisiert. Wie Daten 2 entnehmen steigt A 60 D knapp an. fällt absoluten Beträge Zetapotenziale gleicher Reihenfolge ansteigen, leicht Synthesebedingungen zurückgeführt (Zugabe Durchmesser). Anzumerken C größten Polydispersitätsindex (PDI) hat, bedeutet, breiteste besitzt. Betrachtet obere 2, Beginn Elektrophoreseexperiments (t 0 Helligkeit eindeutig Streuintensität zurückzuführen. Helligkeiten Synthesen beobachten, kleinerer zunehmende Transparenz zeigen. unteren (Agarose, 0,2 40-minütigen angelegten 40 V gezeigt. An Stelle soll erwähnt elektrische konstant, Ort Zeit 31, 32. hier gezeigten Versuche, denen selben verglichen Verteilungen vernachlässigbar klein erachtet. jede heller Bereich erkennen (sogenannte Bande), zeigt, negativ Partikelproben positiv genähert haben (Abb. unten). B, fest, gelaufen wanderten. Demnach wanderte B schneller A, ihr Zetapotenzial absolut betrachtet (die höhere Intensität Bande wiederum stärkere Streuung größeren zurückzuführen). spielt untergeordnete Rolle, unkontrollierte Diffusion beim Ausschalten verhindert, bewirkt, uneingeschränkte definiert höchsten langsamer gewandert scheint Tasche steckengeblieben sein, wodurch gewisse Ausbuchtung am Rand Hieraus geschlussfolgert Partikeldurchmesser sein deshalb einschränkt. Zuletzt eingegangen PDI aufweist. spiegelt erhaltenen wider. D, groß, ungehindert Maschen wandern, andere absolute Folglich beiden Effekten beeinflusst, eingeschränkten Wanderungsmechanismus bewegt. Als maßgeblicher Faktor Verhältnis erkannt verdeutlicht Wanderungsmechanismen. Links man, Masche größer selbst, Richtung FE sprechen sogenannte endoosmotische Fluss EOF Widerstandskraft FR abgebildet, überschüssigen entgegengesetzt Ionen Dispersion darstellt Wanderungsrichtung Partikels entgegengerichtet Üblicherweise hat Einfluss große langkettigen Liganden schwachen Ladungen 33. rechten Abbildung kleinere sehen, Deformierbarkeit Gelnetzwerks) passieren erfährt. Generell Molekülen Hydrogele grundlegende Theorien bekannt 34: i) definiert, Moleküldurchmesser Gelmaschenweite, Siebeffekt/Gelfiltration kommt ii) Reptationstheorie davon ausgeht, groß Moleküle anfangen schlangenförmigen Bewegungen 35. Interessanterweise Parrish 36 berichtet, vierfach durchschnittliche solches Allerdings oben erwähnt, teilweise Fehlern behaftet. Hydrogel viskoelastisch 37, Dehnung Deformierung diesen Gründen beeinflusst. Prinzipiell weitreichende hydrodynamische Phänomene, elektrokinetische Interaktionen (pH-Wert, elektronische Doppelschicht NP) kurzreichende sterische Gelmaschen 16, 38, 39. 4a–c Experimente binärer Partikelmischungen präsentiert. jeden Foto Abschluss welches resultierenden (jeweils links mittig) binären Mischung (rechts) zeigt. jeweiligen Längen angegeben. getrennten extrahiert geeigneten charakterisiert, Trennerfolg verifizieren. 4a demnach Nutzung Wanderungsmechanismus. Vergleicht Mischung, deutlich, erfolgreich war. homogen ortsabhängig erwärmt, Smiling-Effekt kommen, äußeren 40. Aufgrund sichtbare etwas entsprechende Mischung. Feststoffgehalte Banden, individuelle Trennergebnis näher betrachten, Gelfragmente Skalpells ausgeschnitten, leitfähige REM-Kohlenstoffplättchen (∅ mm) platziert Vakuum Exsikkator getrocknet. Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigten, oberen enthalten (obere REM-Aufnahme), zuzuordnen untere passendem (untere REM-Aufnahme). erfolgreiche etabliert Durchmessern eingeschränkt ohne signifikante Verlangsamung 4b SiO2-Mischung Partikeloberfläche. nominellen synthetisiert Hälfte Silan (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilan, GLYMO) modifiziert, dahingehend verändern, endständigen freien Epoxy-Gruppen (Oxirangruppen) belegt schematische Zeichnung Oberfläche eingesetzt (rot: SG Epoxy-Gruppen; schwarz: S Modifikation organische Gruppen), verschiedene besitzen. Mechanismus Prozesse vorteilhafter Wanderung, mögliches Verstopfen langsame Wanderungsprozesse verbunden langen Elektrophoresedauer vermeiden. Experiment Pool-Methode, Ninhydrin-Test 41, 42 freier Aminogruppen geeignet Zu (S SG) zuvor 1-Aminopropan-2-ol hinzugefügt, 12-stündigen Reaktion 85 kovalent anbindet, Substanz ungebunden Bei Anwesenheit ergibt violette Färbung Überstands. Dementsprechend beweist farblose Funktionalisierung GLYMO; verifiziert 4c sehen. 29 stäbchenförmigen seeded growth-Synthese hergestellt anschließend 11-Mercaptoundecansäure stabilisiert, (pH ∼ 8,3) negatives elektrostatische repulsive angegebenen -längen Aufnahmen Transmissionselektronenmikroskop semi-automatisierte Segmentationsroutine mehr 1000 ermittelt 43, 44. akt