کشت آزمایشگاهی فولیکول های پره آنترال جدا شده از بافت تخمدان منجمد و ذوب شده روش مناسبی جهت دستیابی به تخمک بالغ در بیماران در معرض خطر ناباروری است. با توجه به اهمیت فراوان ژن های اختصاصی فولیکولوژنز در فرآیند بلوغ تخمک، بررسی اثرات این روش بر میزان بیان ژن های دخیل در بلوغ و تکوین اولیه جنین پس از انجماد بافت ضروری به نظر می رسد. جهت انجام این مطالعه، تخمدان ها از موش سوری ماده 12 روزه جدا شده و به طور تصادفی در گروه های کنترل، تست سمیت، انجمادی needle immerse (niv) و انجمادی solid surface (ssv) قرار گرفتند. در گروه های انجمادی و تست سمیت تخمدان ها ابتدا به محلول های تعادلی و انجمادی منتقل گشته و سپس در گروه niv بوسیله سوزن طب سوزنی و به طور مستقیم و در گروه ssv پس از سرد شدن بر روی صفحه فلزی از پیش سرد شده به نیتروژن مایع منتقل شدند. موفولوژی بافت تخمدان در گروه های کنترل، تست سمیت و انجمادی niv وssv با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین مورد ارزیابی قرار گرفت. در مرحله بعد فولیکول های پره آنترال با قطر متوسط با روش مکانیکی از تخمدان های کنترل و انجمادی جدا شده و به مدت 12 روز در محیط آزمایشگاه، کشت داده شدند. میزان بقای فولیکول ها و میزان کمی بیان ژنهای موثر در بلوغ تخمک (gdf9,bmp15,fgf8)، گیرنده های آنها (bmprii,alk5,alk6,fgfr4) ، ژن های دخیل در تکوین اولیه جنین (mater,zar1) و گسترش کومولوسی (has2,ptgs2) در زمان های 24 ساعت،6 روز، 10 روز و 12 روز پس از کشت مورد ارزیابی قرار گرفت. در بررسی های مورفولوژیک تمامیت و یکپارچگی بافت تخمدان در گروه های تست سمیت و انجمادی بخوبی و مشابه گروه کنترل حفظ شده بود. ارزیابی میزان بقای فولیکول ها، کاهش میزان این متغیر در گروه های انجمادی را نسبت به کنترل نشان داد، این کاهش بین گروه های کنترل و ssv در روز های 6 ،10 و 12 کشت و بین گروه های niv و ssv در روزهای 10و12 معنادار شناخته شد (p<0.05). در ارزیابی های کمی بیان ژن های مورد مطالعه، گروه های انجمادی در روزهای میانی کشت (روز6و10)، افزایش میزان بیان را نسبت به گروه کنترل نشان دادند که این افزایش معنادار نبود. نکته جالب توجه در این تحقیق الگوی مشابه بیان ژنهای مذکور میان گروه های کنترل و انجمادی و همسانی آنها در انتهای زمان کشت بود. در نهایت می توان اینطور نتیجه گیری کرد که هر چند الگوی تغییرات میزان بیان ژن های دخیل در بلوغ تخمک و تکوین اولیه جنین در هر دو گروه انجمادی مشابه بود، اما با توجه به میزان بقای فولیکولی بالاتر گروه niv نسبت به گروه ssv به نظر می رسد که niv روش مناسبتری جهت حفظ ذخایر فولیکولی بافت تخمدان باشد.

انجماد شیشه ای و کشت آزمایشگاهی فولیکولهای پره آنترال، روشی مناسب جهت حفظ باروری افراد در معرض خطر ناباروری است، اما هنوز اثرات این روش بر الگوی بیان ژن های بلوغ در موش سوری بررسی نشده است. جهت انجام این مطالعه، فولیکولهای پره آنترال متوسط از تخمدان های موش سوری نابالغ جدا و به دو گروه انجمادی و کنترل تقسیم شدند. در گروه انجمادی، فولیکولها به ترتیب در محلول های تعادل و انجمادی شستشو داده شده و سپس توسط حامل کرایوتاپ در نیتروژن مایع غوطه ور شدند. این فولیکول ها پس از ذوب در محلولهای سوکروز با غلظت های نزولی، به همراه فولیکولهای گروه کنترل به مدت 13 روز کشت داده شدند. میزان بقا 3-2 ساعت، 4، 8 و 12 روز پس از کشت و همچنین میزان بیان کمی ژن های بلوغ 3-2 ساعت، 4، 8 و 13 روز پس از کشت در هر دو گروه بررسی گردید. در نهایت میزان بلوغ تخمکهای هر دو گروه نیز در روز 13 با یکدیگر مقایسه شد. در بررسی میزان بقای فولیکولها طی روزهای مختلف کشت، گروه انجمادی در همه روزها بقای کمتری را نسبت به گروه کنترل نشان داد (p<0.05). بررسی میزان بلوغ تخمک ها نیز نشان داد که در گروه انجمادی تخمک های بیشتری از مرحله gv خارج شده (p<0.05) و به مرحله mii رسیدند (p>0.05). در ارزیابی کمی بیان ژنی نیز در اکثر ژن های بلوغ و گیرنده میزان بیان در گروه انجمادی به خصوص در روزهای اولیه کشت بالاتر از کنترل بود و در تعدادی از ژن ها از جمله gdf9، bmp15، tgf?1، bmprii و act-rii این تفاوت به صورت معنادار نشان داده شد (p<0.05). از نتایج حاصله می توان این طور نتیجه گیری کرد که انجماد شیشه ای فولیکولها با روش کرایوتاپ هر چند باعث کاهش اندکی در میزان بقای آن ها می شود، اما بر بیان ژن های بلوغ تأثیر منفی نداشته و در کل روشی ایمن جهت حفظ و نگهداری فولیکول های پره آنترال است.

هدف از انجام این مطالعه ارزیابی تغییرات هورمونی و الگوی بیان ژن های رشد فولیکولی بافت تخمدان منجمد شده رت بعد از پیوند اتوگرافت است. در این تحقیق از تخمدان موش صحرایی ماده 5 هفته ای استفاده گردید که در گروه های کنترل، انجمادی، پیوندی و انجمادی- پیوندی مورد ارزیابی قرار گرفتند. بافت تخمدان در فرآیند انجماد، ابتدا به محلول های تعادلی و انجمادی منتقل شده و بلافاصله پس از قرارگیری در محلول ذوب در زیر پوست گردن به صورت اتوگرافت و hetrotopic پیوند زده شد. در نهایت 1 و 3 هفته بعد از پیوند، تخمدان از بدن موش خارج و تحت بررسی های بافت شناسی و ملکولی قرار گرفت. مورفولوژی بافت تخمدان در تمامی گروه های آزمایشی با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین و میزان کمی بیان ژن های اختصاصی دخیل در رشد فولیکولی (bmp15، gdf-9، گرلین، لپتین و رسپتور های آنها ) و رگزایی (vegf) با استفاده از تکنیک real-time pcr بررسی شد. علاوه بر آن برای بررسی عملکرد هورمونی بافت پیوندی میزان ترشح هورمون های lh، fsh، استرادیول، پروژسترون، گرلین و لپتین خون در انتهای دوره پیوند اندازه گیری شد. مطالعات آماری نشان داد به استثنای هورمون گرلین و لپتین که در هفته هشتم پس از تولد اختلاف معنی داری بین گروه کنترل نسبت به گروه های پیوندی و انجمادی- پیوندی داشت اما دیگر هورمون ها تفاوت معنی داری را بین این گروه ها نشان نداند. اگرچه میزان فولیکول های بدوی و اولیه در گروه های پیوندی و انجمادی- پیوندی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داری را داشت اما افزایش معنی داری در تعداد فولیکول های پره آنترال، آنترال و جسم زرد مشاهده شد. میزان بیان ژن رگزایی(vegf) در گروه های انجمادی- پیوندی نسبت به گروه های کنترل، انجمادی، پیوندی افزایش معنی داری را نشان داد. ژن های اختصاصی (bmp15 و gdf9) و غیراختصاصی ( لپتین و گیرنده های لپتین و گرلین ) در گروه های پیوندی و انجمادی- پیوندی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی دار را نشان داد این در حالیست که بیان ژن گرلین تنها در هفته هشتم پس از تولد مانند دیگر ژن های غیراختصاصی بود درحالیکه در هفته ششم تنها گروه انجمادی- پیوندی کاهش معنی داری را نسبت به گروه کنترل و پیوندی نشان داد. همچنین میزان بیان کلیه ژن های دخیل در رشد فولیکولی در گروه انجمادی نسبت به گروه کنترل در هفته پنجم پس از تولد کاهش معنی داری را داشت. نتایج این تحقیق علی رغم آسیب هایی که در طی پروسه ی پیوند و انجماد بر بافت تحمیل می گردد، نشان داد که بافت تخمدان در گروه پیوندی و انجمادی- پیوندی توانست با برقراری مجدد سیکل هورمونی، فرآیند رشد فولیکولی را از سر گیرد که افزایش تعداد فولیکول های پره آنترال، آنترال و جسم زرد و همچنین افزایش بیان ژن رگزایی دلیلی بر بهبود عملکرد بافت است. همچنین مطالعاتی که بر روی بیان فاکتورهای رشد فولیکولی صورت گرفته است نشان می دهند که میزان بیان این فاکتور ها تا مرحله پره آنترال به حداکثر میزان خود می رسند. اما به تدریج میزان بیان این ژن ها سیری نزولی را در پیش می گیرند که این مطلب به نوعی در مطالعه حاضر نیز مشاهده شد و تاییدی بر نتایج مطلوب بدست آمده در بررسی فاکتورهای رشد است.

به منظور مقایسه اثر انجمادآهسته و شیشه ای بافت تخمدان بر روند رشد فولیکول پرآنترال کشت داده شده در سیستم سه بعدی و الگوی بیان ژن های بلوغ و تکوین فولیکول ها، تخمدان های موش های سوری نابالغ ماده 14-12 روزه در سه گروه کنترل، انجمادشیشه ای و انجمادآهسته مورد مطالعه قرارگرفتند. در انجمادآهسته تخمدان هادر فریزر برنامه ریزی شده منجمد شدند و در انجمادشیشه ای نیز در محلول های انجمادی به روش needle immersed انجام شد. در مرحله بعد فولیکول های پرآنترال با قطر متوسط به روش مکانیکی از تخمدان-های تازه و منجمد- ذوب شده جدا و به مدت 12 روز در سیستم کشت سه بعدی در سدیم-آلژینیت 0/7% کشت داده شدند. میزان بقا، رشد فولیکول ها، شکل گیری حفره آنتروم و میزان بیان ژن های موثر در بلوغ تخمک (bmp15، gdf9،fgf8 ،igf1 ، kit،kit-l ) پس از 1، 8 و 12 روز کشت، بررسی شد. در نهایت میزان بلوغ تخمک های کشت داده شده ارزیابی گردید. طی ارزیابی بافت شناسی یکپارچگی بافت تخمدان درهر دو گروه انجمادی مشابه گروه کنترل بود. در بررسی میزان بقای فولیکول ها، هر دو گروه انجمادی در روز 8 و 12 بقای کمتری را نسبت به گروه کنترل نشان دادند (0/05 >p). تخمک های یکسانی نیز در هر سه گروه از مرحله gv خارج شده و به مرحله mii رسیدند. ارزیابی میزان بیان رونوشت ژن‏های بلوغ، روند نزولی ژن-های bmp15، gdf9،fgf8 ، kit،kit-l در هر سه گروه را طی کشت نشان داد. مقایسه ی بین گروه های مورد مطالعه افزایش بیان سه ژن kit ، kit-l و gdf-9 در گروه انجمادشیشه ای و ژن igf-1 در گروه انجمادآهسته طی روز اول کشت را نشان داد (0/05 >p). با توجه به نتایج مذکور، فولیکول های زنده مانده پس از فرایند انجماد و ذوب در هر دو گروه انجمادی با انجام یک واکنش جبرانی نه تنها بقای خود را حفظ و به رشد خود ادامه دادند، بلکه به صورت یکسان بر تکوین تخمک ها تأثیرگذار بودند.

امروزه انجماد بافت تخمدان به دو روش آهسته و شیشه¬ای صورت می¬گیرد، گرچه هنوز روش مناسب برای انجماد بافت تخمدان و تاثیر روش¬های انجمادی بر الگوی بیان ژن¬های بلوغ مورد سوال است. در این مطالعه ابتدا تخمدان¬ها از بدن موش سوری نابالغ خارج و به سه گروه کنترل، انجمادآهسته و شیشه¬ای تقسیم شدند. در گروه انجماد آهسته تخمدان¬ها با استفاده از دستگاه فریز برنامه¬ریزی شده، و در گروه انجماد شیشه ای تخمدان ها به روش niv منجمد شدند. موفولوژی بافت تخمدان در گروه های کنترل و انجمادی بعد از ذوب با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین مورد ارزیابی قرار گرفت. فولیکول¬های پیش آنترال با روش مکانیکی از تخمدان¬های گروه کنترل و تخمدان¬های منجمد- ذوب شده گروه انجماد آهسته و شیشه¬ای جدا و به مدت 12 روز کشت داده شدند. میزان بقا 1، 8 و 12 روز پس از کشت و همچنین میزان بیان کمی ژن¬های بلوغ 1، 8 و 12 روز پس از کشت در هر سه گروه بررسی گردید. در نهایت میزان بلوغ تخمک¬های هر سه گروه نیز در روز 13 با یکدیگر مقایسه شد. . در بررسی های مورفولوژیک تمامیت و یکپارچگی بافت تخمدان در گروه های انجمادی بخوبی و مشابه گروه کنترل حفظ شده بود. در بررسی میزان بقای فولیکول¬ها طی روزهای مختلف کشت، گروه انجماد آهسته در روزهای 8 و 12 کشت بقای کمتری نسبت به گروه کنترل نشان داد (p<0.05)، گروه انجماد شیشه¬ای نیز نسبت به گروه کنترل و انجماد آهسته در تمامی روزهای کشت بقای کمتری نشان داد(p<0.05). بررسی میزان بلوغ تخمک ها نیز نشان داد که هیچ تفاوت معنی داری بین سه گروه مورد آزمایش وجود ندارد. در ارزیابی کمی بیان ژنی نیز در همه ژن¬های بلوغ به جز igf1، میزان بیان در گروه¬های انجمادی در روز 1 کشت بالاتر از کنترل بود، که این میزان در ژن bmp15 در هر دو گروه انجمادی و در ژن kit-l در گروه انجماد شیشه ای نسبت به کنترل به طور برجسته بیشتر بود (p<0.05). از نتایج بدست آمده می¬توان این طور نتیجه گیری کرد هرچند هر دو روش انجماد آهسته و شیشه¬ای بافت تخمدان بر بیان ژن¬های بلوغ تأثیر منفی نداشته، اما با توجه به میزان بقا بیشتر در گروه انجماد آهسته این روش مناسبت تر برای انجماد بافت تخمدان و حفظ ذخایر فولیکولی آن می¬باشد.