چکیده: پدیده بیولومینسانس تبدیل انرژی شیمیایی به نور توسط موجودات زنده را گویند که واکنشی آنزیمی می باشد که به واسطه دخالت آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین انجام می گیرد. لوسیفرازآنزیمی پراکسیزومی می باشد که طی دو مرحله، مرحله ی لیگازی با استفاده از atp و mg2+ و مرحله ی مونواکسیژنازی و با استفاده از o2 باعث تبدیل سوبسترای خود (لوسیفرین) به ترکیب برانگیخته ی اکسی لوسیفرین می شود که در هنگام برگشت به حالت پایه ایجاد نور با بازده کوانتومی بالا می کند. آنزیم لوسیفراز دارای کاربردهای فراوان صنعتی و تشخیصی می باشد ولی عواملی همچون پایداری پایین لوسیفراز نسبت به حرارت و km بالا برای سوبسترای atp استفاده از آن را محدود کرده است. از این روی درسالهای اخیر با توسعه فناوری و با بکارگیری جهش زایی های هدفمند سعی در تهیه نمونه جهش یافته مناسب برای بهره گیری بیشتر از این آنزیم صورت گرفته است. مطالعات مهندسی پروتئین برای این آنزیم حاکی از این است که اسید های آمینه باردار دارای فراوانی بالایی بخصوص در نواحی سطحی پروتئین های گرما دوست می باشند. همچنین مطالعات قبلی بیانگر این است که جهش زایی در جایگاه 300 آنزیم لوسیفراز برخصوصیات سیننتکی وپایداری تاثیر می گذارد . به منظور ارزیابی اثر بارهای سطحی اسیدهای آمینه باردار و نقش جایگاه 300 )که در لوپ سطحی واقع شده است ( بر پایداری آنزیم لوسیفراز، جهش زایی در لوسیفراز lampyris turkestanicus به صورت جهش های منفرد l300r,l300k,l300e انجام شد. بیان و تخلیص هر دو لوسیفراز طبیعی و جهش یافته جهت مطالعه ویژگیهای سنتتیکی و ساختاری صورت گرفت. طیف سنجی نشری بیانگر این است که جایگزینی این اسید آمینه با اسیدهای آمینه باردار در 7.8=ph بر روی ماکزیمم طول نشری فاقد اثر است. افزایش فعالیت ویژه لوسیفراز برایe l300k,l300 نیز مشهود است. جهش زایی l300r با افزایش دمای بهینه همراه بود. بررسی فعالیت باقی مانده نسبی درشرایط 35 درجه بمدت 60 دقیقه بیانگر افزایش فعالیت باقی مانده در جهش یافته l300r,l300k نسبت به نمونه طبیعی بوده است.

لوسیفراز حشره شب تاب یک آنزیم مونواکسیژناز بوده و در حضور atp، لوسیفرین را به لوسیفریل-آدنیلات تبدیل نموده که در یک واکنش چند مرحله ای، به حالت برانگیخته اکسی لوسیفرین تبدیل می شود. با برگشت اکسی لوسیفرین برانگیخته به حالت پایه، تولید نور سبز رنگ می نماید. نور تولید شده توسط این آنزیم، یکی از حساس ترین ابزارهای تشخیص دقیق atp بوده و به منظور اندازه گیری آلودگیهای میکروبی، سنجش گزارشگرهای ژنتیکی در بیولوژی مولکولی و در تعیین توالی dna استفاده می شود. با این حال، آنزیم لوسیفراز بسیار ناپایدار است و به سرعت فعالیت خود را حتی در دمای اتاق از دست می دهد. این امر منجر به از دست رفتن حساسیت و دقت کاربردهای تشخیصی آنزیم می شود. به همین دلیل به منظور استفاده بیشتر از این آنزیم و توسعه این فناوری، تلاشهای بسیاری با جهش زایی هدفدار برای جداسازی یک نمونه جهش یافته با ویژگی های مناسب انجام شده است. مطالعات مهندسی پروتئین نشان داده است که پروتئین های گرمادوست، دارای فراوانی بیشتری از اسیدهای آمینه آرژنین به ویژه در نواحی سطحی می باشند. به منظور بررسی اثر ایجاد بارهای سطحی آرژنین بر پایداری آنزیم لوسیفراز و مطالعه بیشتر نقش لوپ ها در پایداری آنزیم، تعدادی از اسیدهای آمینه سطحی در معرض حلال در آنزیم لوسیفراز lampyris turkestanicus به آرژنین تغییر داده شدند. همه این اسیدهای آمینه در بخش لوپ های سطحی آنزیم لوسیفراز l. tu قرار دارند. جهش های اولیه بر روی نمونه های جهش یافته e354q/arg356 و e354r/arg356 و بصورت جهش های منفرد q35r، i182r، i232r و l300r و سپس جهش های دوتایی q35r/i232r و جهش های سه تایی q35r/i232r/i182r ایجاد شدند. لوسیفرازهای طبیعی و جهش یافته، بیان و تخلیص شده و ویژگیهای سینتیکی و ساختاری آنها مورد مطالعه قرار گرفت. طیف های نشری بیولومینسانس نشان می دهند که جایگزینی این اسیدهای آمینه با آرژنین، اثری بر ماکزیمم طول موج نشری آنزیم ندارد. همچنین جهش یافته های دوگانه e354q/arg356 و سه گانه q35r/i232r/i182r فعالیت ویژه لوسیفراز را حفظ کرده اند. با افزودن آرژنین، دمای بهینه فعالیت جهش یافته های i232r ، e354q/arg356 و q35r/i232r/i182r به °c 40 افزایش یافته که °c 15 بیشتر از لوسیفراز طبیعی می باشد. همچنین، بعد از نگهداری نمودن نمونه ها به مدت 40 دقیقه در دمای °c40، فعالیت باقی مانده نسبی آنزیم طبیعی فقط در حدود 5% فعالیت اولیه آن می باشد در صورتیکه فعالیت باقی مانده برای نمونه های i232r ، e354q/arg356 و q35r/i232r/i182r به ترتیب در حدود 60، 80 و 80 درصد فعالیت اولیه می باشد.

ازمک (lepidium draba) گیاهی دولپه از خانواده brassicaceae است. این گیاه توانایی بالایی در جذب و ذخیره نمودن فلزات سنگین دارد. این گیاه همچنین حاوی گلوکوزینولات گلوکورافانین است که تحت تاُثیر فعالیت آنزیم میروزیناز می تواند سولفارافان تولید نماید که اثرات درمانی متعددی دارد. در این مطالعه، اثرات غلظت¬های مختلف (0 (به عنوان شاهد)، 1، 20،10،5 و 40 میلی گرم بر لیتر) نانو ذرات آلومینا و همچنین بالک آن در سه زمان 8، 16 و 32 ساعت بر محتوی سولفارافان در گیاهچه های 7 روزه ازمک مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دهنده تاثیر مثبت این ذرات بر محتوی سولفارافان می باشد. بیشترین تاثیر این ذرات، توسط نانوذرات و در زمان 8 ساعت تیمار بدست آمد. از طرف دیگر، خصوصیات بیوشیمیایی و مرفولوژیکی گیاهچه های ازمک که به مدت 7روز در حضور غلظت های مختلف (0(به عنوان شاهد)، 25، 50، 250، 500 و1000 میلی گرم بر لیتر) این ذرات رشد نمودند، مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج نشان دهنده کاهش معنی دار میزان جوانه زنی، طول ساقه و ریشه و همچنین محتوی کلروفیل کل و کاروتنوئید در گیاهچه های تیمار شده با هر دو ذره نسبت به نمونه شاهد می¬باشد. درحالیکه، بیومس گیاهچه ها در مقایسه با نمونه شاهد تغییری را نشان نداد. از طرف دیگر، در مقابل کاهش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز ، افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز و آنزیم پراکسیداز و همچنین افزایش محتوی فلاونوئید کل در گیاهچه های تیمار شده مشاهده شد. در تمامی موارد تاُثیر نانوذرات بیشتر از نمونه بالک بود. نکته جالب توجه، افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در نمونه های تیمار شده با نانوذرات بود که با بیان ژن این آنزیم همخوانی داشت .نتایج همچنین نشان دهنده تجمع آلومینیوم در ریشه و ساقه گیاهچه¬های تیمار شده می باشد. جذب بیشتر آلومینیوم در گیاهچه های تیمار شده با نانوذرات می¬تواند دلیل تاثیر بیشتر نانوذرات نسبت به حالت بالک باشد. با توجه به افزایش محتوی فلاونوئید کل، افزایش فعالیت آنزیم¬های کاتالاز و پراکسیداز و همچنین محتوی سولفارافان در زمان 8 ساعت تیمار چنین پیشنهاد می شود که جذب این ذرات به سطح و یا تجمع آن ها در گیاهچه¬ها منجر به تنش اکسداتیو و در نتیجه کاهش رشد گیاه شده است.

فاکتور رشد اپیدرمی(egf)، یک عضو از خانواده ی گسترده ی مولکولی با 53 باقی مانده ی اسید آمینه در یک زنجیره ی پلی پپتید تک رشتهای است و دارای وزن مولکولی 2/6 کیلو دالتون می باشد. همه ی اعضای خانواده ی egf، شباهت زیادی در ویژگی های ساختاری، عملکردی و اثرات بیولوژیکی دارند. به علاوه شامل یک یا بیشتر توالی آمینواسیدی تکراری محافظت شده هستند. این توالی محافظت شده شامل شش باقیمانده-ی سیستئین است که سه باند دی سولفیدی داخل سلولی را تشکیل می دهند. فاکتور رشد اپیدرمی یک نقش ضروری در روند بهبود زخم با تحریک تکثیر و انتقال کراتینوسیت ها ایفا می کند. تولید پروتئین های نوترکیب، مخصوصا پروتئین هایی که کاربرد دارویی دارند، در استراتژی طراحی دارو از اهمیت فوق العاده ای برخوردار است. به علاوه استفاده از این ترکیب در بهبود زخم، خصوصا زخم هایی که منجر به سوختگی می شوند، پیشبرد تحقیقات در این زمینه را ضروری و مهم کرده است. بسیاری از مطالعات به تولید hegf با استفاده از تکنولوژی dna نوترکیب اقدام کرده اند. ولی تا به حال بازدهی بالایی از میزان تولید hegf نوترکیب سیتوپلاسمی و فعال گزارش نشده است. به دلیل بالا بودن سرعت بیان پروتئین های نوترکیب در سیستم های بیانی مانند اشریشیاکلی، پروتئین های نوترکیب به سرعت در سیتوپلاسم تجمع یافته و تولید اجسام نامحلول را می دهند. به علاوه به دلیل احیایی بودن سیتوپلاسم باکتری امکان ایجاد تشکیل پیوند های دی سولفید پروتئین وجود ندارد و پیوند های دی سولفید برای فعالیت و عملکرد پروتئین ضروری می باشند. بنابراین برای دستیابی به بازدهی بالای پروتئین نوترکیب فعال و دارای عملکرد زیستی و محلول، بهینه سازی شرایط تولید اهمیت بسزایی دارد. هدف از این مطالعه ساختن سازه هیبرید-hegf نوترکیب که برای بیان hegf در سویه ی ایکلای t7 شافل استفاده می شود. این سویه برای تولید پروتئین های حاوی باند دی سولفید در سیتوپلاسم مهندسی شده است. نتایج ما نشان داد که برای تولید پروتئین های یوکاریوتی کوچک با باند دی-سولفید مانند hegf سویه ی t7 شافل مناسب می باشد. و با استفاده از بهینه سازی کدونی ژن فاکتور رشد اپیدرمی براساس ترجیح کدونی ایکلای و استفاده از enhancer tag در بالادست ژن برای القای ساختار صحیح پروتئین و بیان ژن در سویه مناسب t7 شافل ایکلای به تولید بالای این پروتئین به صورت محلول با فعالیت زیستی بالا در سیتوپلاسم با متوسط غلظت 94/3 میلی گرم بر میلی لیتر پروتئین خالص سازی شده دست یافتیم.

الف - تاثیر و رابطه وزن در فعالیتهای غیرهوازی(پرش عمودی، دوی 50 متر سرعت ) افراد مختلف در فعالیتهای ورزشی که از منبع انرژی غیرهوازی استفاده می شود( فعالیتهایی که در زمانی معمولا" 20 ثانیه یا کمتر پایان می پذیرد)، تا چه حدی دخالت می تواند داشته باشد. ب - چگونه می توان از نقش وزن بدن برای بالابردن ظرفیت غیرهوازی استفاده کرد؟. ج - آیا تاثیر وزن در پرش عمودی بیشتر است یا دوی 50 متر سرعت ؟.