نوروتوکسین های بوتولینوم، پروتئین های بسیار سمی هستند که از یک زنجیره سنگین (100کیلو دالتون) و یک زنجیره سبک (50 کیلودالتون) تشکیل شده اند. دارای هفت سروتیپ (a-g) و مسئول سندروم بوتولیسم هستند. در این مطالعه، پلی پپتید هایی به طول 54، 45 و 48 اسید آمینه، به ترتیب از سروتیپ های a, b, e نوروتوکسین های بوتولینوم انتخاب و با استفاده از یک لینکر آب گریز به هم متصل و پس از بررسی های بیوانفورماتیک و بهینه سازی ژن، پروتئین کایمر حاصل در میزبان اشرشیاکلی بیان شد. پروتئین کایمر، پس از خالص سازی با روش الیزا و وسترن بلات تایید شد. برای ارزیابی توان مصونیت زایی، پروتئین کایمر به گروه های موشی تزریق شد و تولید آنتی بادی و مصونیت زایی آن بررسی شد. نتایج، نشان دهنده آنتی ژنیسیتی و مصونیت زایی آن بود. همچنین، این پروتئین به مرغ تزریق شد. آنتی بادی مرغی تولید شده در مرغ، از زرده تخم مرغ ها تخلیص شد و توان خنثی سازی آن به شکل خوراکی در مدل موش مطالعه شد. نتایج، نشان داد که این آنتی بادی، توان خنثی سازی نوروتوکسین های بوتولینوم را ندارد. همچنین، در این تحقیق، برای هر یک از نوروتوکسین های بوتولینوم، دو پپتید اپی توپی ( به استثنای تیپ e که یک اپی توپ انتخاب شد) به طول 19 اسید آمینه، انتخاب شد و به تنهایی و یا به همراه پپتید سیناپتوتاگمین ( به عنوان گیرنده نورروتوکسین های بوتولینوم) به گرو های موشی تزریق شدند. همه پپتید ها به غیر از پپتید تیپ e توانستند در موش، آنتی بادی تولید کنند، اما نتوانستند اثر نوروتوکسین های فعال را خنثی نمایند. تزریق پپتید سیناپتوتاگمین به همراه پروتئین کایمر و پپتیدهای تیپ a وb اثرات متفاوتی در پاسخ ایمنی موش به آنتی ژن های مذکور داشت. پاسخ ایمنی موش ها به پپتید های اپی توپی تیپ های aو b در حضور این پپتید گیرنده، سرکوب شده ولی در مورد پروتئین کایمر، تحریک شد. نتایج این تحقیقات نشان دادکه پروتئین کایمر، از خاصیت آنتی ژنی و توان مصون سازی همزمان علیه سه سروتیپ را دارد. اما، آنتی بادی مرغی این توان را ندارد. همچنین پپتید های آنتی ژنی توان ایمنی زایی را ندارند.

به علت افزایش میزان مقاومت های آنتی بیوتیکی، acinetobacter baumannii یکی از مشکلات سلامت عمومی و تهدید بزرگی برای بیماران بستری در بیمارستان، رفت و آمد کنندگان به بخش مراقبت های ویژه نیروهای نظامی محسوب میشود. ممکن است واکسیناسیون این گروهای خطر وقوع و گسترش عفونت های مرتبط با آن را کاهش دهد. در مطالعه ی حا ضر امکان تحریک سیستم ایمنی خونی و سلولی توسط یکی از فاکتور های بیماریزای این باکتری بنام فسفولیپاز d توسط روشهای بیوانفورماتیکی مورد بررسی قرار گرفت. سپس بعد از تعیین فراوانی ژن pld در بین جدایه های بالینی جمع آوری شده از طریق pcr امکان استفاده از پروتئین نوترکیب pld بعنوان واکسن زیر واحدی در مدل موشی سنجیده شد. در عین حال پروتئین pld و پروتئین مرتبط با بیوفیلم (bap) بر روی باکتری lactococcus lactis نمایش داده شدند و کارائی این باکتریهای نوترکیب به عنوان واکسن خوراکی در مدل موشی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی پایداری دمائی نیمه عمر طولانی، عدم شباهت به پروتئینهای انسانی و موشی و باکتریهای فلور روده و غیر آلرژی زا بودن پروتئین pld را نشان داد. توالی های اپیتوپی تحریک کننده ی سیستم ایمنی خونی و سلولی نیز در این پرتئین شناسائی شدند. همچنین یک کاندیدای واکسن پپتیدی بر علیه این باکتری و چند باکتری دیگر بیماریزای انسانی معرفی شد. نتایج pcr وجود ژن pld را در همه ی جدایه ها نشان داد. کاندیدای واکسن زیر واحدی pld باعث تولید مقادیر قابل توجهی آنتی بادی بر علیه pld شد. موش های ایمن دریافت کننده ی دوز های کشنده ی108 ، 109و 1010 از باکتری a. baumannii 100% زنده ماندند. در گروه دریافت کننده ی 1011 این میزان به 80% تقلیل یافت. همه موش های غیر ایمن مردند. موش های غیر ایمن در یافت کننده ی 108 و 109باکتری 100% زنده ماندند. این میزان با دریافت 1010و 1011 باکتری یه 60% افت پیدا کرد. موش هایی که به صورت دهانی l. lactis نمایش دهنده ی pld یا bap دریافت کردند نیز افزایش میزان igg را نشان دادند. موش های ایمن شده با باکتری نمایش دهنده ی pld با دریافت 108 و 109باکتری 100% زنده ماندند. . این میزان با دریافت 1010و 1011 باکتری یه ترتیب 80% و 40% بود. موش های ایمن شده با باکتری نمایش دهنده ی bap با دریافت 108،109 و1010باکتری % 100 محافظت شدند. 80% محافظت حاصل استفاده از 1011 باکتری بود. همه موش های کنترل در عرض 24 بعد از چالش مردند. نتایج آزمایشگاهی نشان می دهد هم واکسن نوترکیب و هم واکسنهای خوراکی به طور معنی داری باعث تولید آنتی بادی و حفاظت موش ها از عفونت های حاصل از a. baumannii میشود

مقدمه: پروتئین های وابسته به خانواده سیستم ترشحی دوجزئی می توانند درچسبندگی باکتری نقش داشته باشند. چسبندگی برروی سطوح، به عنوان یک عامل بیماریزایی، اولین گام در انجام فرایند تجمع باکتریایی می باشد. اسینتوباکتربومانی دارای توانایی ویژه ای برای کلونیزاسیون برروی سطوح مختلف است. هدف از انجام این تحقیق، شناسایی، مطالعه و بررسی نقش پروتئین های این خانواده در چسبندگی اسینتوباکتربومانی به سلول اپی تلیال انسانی و تشکیل بیوفیلم است. مواد و روش: در این مطالعه ابتدا هومولوگ ژن های کد کننده پروتئین چسبندگی، وابسته به سیستم ترشحی دوجزئی در ژنوم اسینتوباکتربومانی با کمک نرم افزارهای بیوانفورماتیک در بانک ژنی آنالیز و سپس آغازگرها طراحی شدند. دو ادهسین غشای خارجی مشابه به پروتئین های fha که ترکیبی از اگزوپروتئین fhab (fhab1 & fhab2) و پروتئین کانال fhac (fhac2 & (fhac1 است، همسانه سازی شدند. بیان هر یک از اگزوپروتئین ها و کانال مربوط به آن (fhab1& fhac1) و(fhab2&fhac2) تحت کنترل دو پروموتور مجزا در یک سلول به نام fhab1c1 و fhab2c2 و همچنین هریک در سلول مجزا fhab1 و fhab2 مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان بیان پروتئین های مورد مطالعه در سطح غشای خارجی سلول باکتری ارزیابی شد. سپس ژن های کد کننده پروتئین های کانال fhac1 و fhac2 جهش یافته و همراه با اگزوپروتئین مرتبط خود به سلول اشریشیاکلی bl21de3 ترانسفورم شدند. محصول این ترانسفورم به نام سلول های mfhab1c1 و mfhab2c2 نام گذاری شدند. توانایی چسبندگی به سلول های اپی تلیال انسانی این سویه های نوترکیب با سویه های جهش یافته و اسینتوباکتربومانی در شرایط آزمایشگاهی مقایسه شد. همچنین توانایی تشکیل بیوفیلم روی سطوح غیرزنده در سویه های جهش یافته با اسینتوباکتربومانی، fhab1c1، fhab2c2 مقایسه شدند. در مرحله بعد پروتئین کایمر(k) که ترکیبی از منطقه آنتی ژنی درقسمت های حفاظت شده اگزوپروتئین (b) و کانال (c) است، سنتز شد. از آنتی بادی علیه پروتئین کایمر برای شناسایی بیان پروتئین های نوترکیب تولید شده در آزمایشگاه، استفاده شد. سپس موش های ایمن شده با هر یک از پروتئین های کانال، اگزوپروتئین و کایمر در برابر اسینتوباکتربومانی وfhab1c1 چالش یافتند. یافته ها ونتایج: دو محصول ژنی از پروتئین های سیستم ترشحی دو جزئی اسینتوباکتربومانی atcc19606 شناسایی شده، به نام اگزوپروتئین fhab2) و fhab1 ) و کانال(fhac1و(fhac2 شناخته شده اند. دو هومولوگ پروتئین fha ، fhab1 با وزن مولکولی 110کیلودالتون و fhab2 با وزن مولکولی 190 کیلودالتون حدودا 48% تشابه دارند که به دلیل حضور موتیف چسبندگی npgx است که در تشکیل بیوفیلم نقش دارد. قرار گرفتن اگزوپروتئین در سطح غشای خارجی سلول به روش الایزای سلول کامل و وسترن بلات تایید شده است. سلول های جهش یافته mfhab1c1,mfhab2c2 فاقداگزوپروتئین fhab در سطح غشای خارجی است. بیان اگزوپروتئین در سلول fhab1c1 سبب افزایش چسبندگی سویه های نوترکیب به سلول های اپی تلیال ریه a549 و helaمی شود. نتایج آزمایشات نشان داده است که fhab1 سبب افزایش چسبندگی باکتری و تشکیل بیوفیلم می شود. تشکیل بیوفیلم روی سطوح پلی استرن در سویه های fhab1c1 و fhab2c2 بیشتر از سایر گروه ها بوده است. سویه های هیدروفوبیک ظرفیت بیشتری برای تشکیل بیوفیلم نشان داده اند. ایمنی زایی با پروتئین های نوترکیب b و k حیوان را در برابرآلودگی اسینتوباکتربومانی و fhab1c1 حفاظت می کند. بحث: دمین fha نقش بسیار مهمی در تشکیل بیوفیلم و چسبندگی اسینتوباکتربومانی به بافت و شکل گیری بیوفیلم ایفاء می کند و بر اساس نتایج این مطالعه اگزوپروتئین های وابسته به سیستم ترشحی دو جزئی می تواند در ایمنی زایی فعال و غیر فعال بر علیه اسینتوباکتربومانی بکاررود.

با وجود پیشرفت بشر در زمینه کنترل بیماری های عفونی، بیماری مننژیت همچنان به عنوان یکی از علل اصلی ناتوانی جسمی و مرگ ناگهانی در سراسر جهان است. باکتری نایسریا مننژیتیدیس یکی از شایع ترین عوامل ایجاد کننده مننژیت است که می تواند در طول یک دوره بیماری همه گیر، 1000 مورد عفونت جدید را در هر 100000 نفر ایجاد کند. بیوسنسورها پتانسیل بسیار بالایی برای تشخیص سریع عوامل بیماری زا دارند. در این زمینه، الیگونوکلئوتیدهای صناعی(dna یا rna) که اپتامر نام دارند، می توانند به عنوان جایگزین آنتی بادی ها برای تشخیص پاتوژن ها استفاده شوند. کاهش هزینه ها، سهولت در تهیه و اصلاح و افزایش میزان پایداری، از مزایای اپتامرها نسبت به آنتی بادی ها می باشد. در این تحقیق با استفاده از یک کتابخانه اپتامری، dna اپتامرهایی با اتصال اختصاصی به نایسریا مننژیتیدیس زیرگروه b با روش تکامل سیستماتیک کل سلول از لیگاندها به وسیله غنی سازی نمایی (selex) انتخاب شدند. پس از 8 دور انتخاب علیه نایسریا مننژیتیدیس زیرگروه b(atcc 13090) مجموعه اسیدنوکلئیک غنی با برچسب فلوئورسنتی با استفاده از روش فلوسایتومتری، بدست آمد. نایسریا مننژیتیدیس زیرگروه y(atcc 35561)، نایسریا لاکتامیکا(atcc 23970)، لیستریا مونو سایتوژنز(atcc 7644)، اشرشیا کولی(atcc 11775)، استفیلوکوکوس اورئوس(atcc 25923)، اسینتوباکتر بومانی(atcc 19606)، هموفیلوس انفولانزا نوع b (atcc 10211)، استرپتوکوکس پنومونیه(atcc 33400) در دور سوم و پنجم به عنوان اهداف کانتر درنظر گرفته شدند. اپتامرهای بدست آمده از selex هشتم کلون شدند. 68 کلون بدست آمد که میزان تمایل اپتامرهای 21 کلون به باکتری مورد نظر با روش فلوسایتومتری بررسی گردید. از میان این اپتامرها، 8 اپتامر با میل ترکیبی بالا بدست آمد که از میان آن ها 3 اپتامر تعیین توالی شدند. اپتامرهای k3 و k4 بالاترین تمایل را به نایسریا مننژیتیدیس زیرگروه b و کمترین تمایل را به نایسریا مننژیتیدیس زیرگروه y و باکتری های کانتر نشان دادند. ثابت تقکیک ظاهری ( ارزش kd) برای اپتامر k3 و k4 به ترتیب 8.9 ± 28.3 پیکومول و39.1±8.6 پیکومول محاسبه گردید که اپتامر k3 با کمترین میزان kd به عنوان اپتامر اصلی انتخاب گردید. در این تحقیق به کمک روش selex cell اپتامرهایی بر علیه پاتوژن میکروبی نایسریا مننژیتیدیس از مجموعه باکتری های ایجاد کننده مننژیت بدون نیاز به تخلیص به دست آمد. امید است این اپتامر در تحقیقات بعدی در یک کیت تشخیصی یرای شناسایی باکتری نایسریا مننژیتیدیس بکار گرفته شود.