ماتریکس خارج سلولی (ecm)، بخش پویا و پیچیده ی همه ی بافت ها، به ویژه بافت پیوندی است و از کلاژن، انواع پروتئوگلیکان ها و گلیکوپروتئین ها تشکیل شده است. مهاجرت سلول ها در طول دوره ی تکوین و مورفوژنز، بهبود زخم ها، بازآرایی بافتی و امثال آن ها، همگی، نیازمند تخریب کنترل شده ی این ماتریکس است. تجزیه ی کنترل نشده ی ecm، ارتباط تنگاتنگی با انواع بیماری ها، از جمله، سرطان و بیماری های قلبی-عروقی دارد. سرین/ترئونین پروتئازها و ماتریکس متالوپروتئینازها (mmps) دو گروه آنزیمی مسئول تخریب ecm هستند و از این بین، mmpها از اهمیت بیشتری برخوردارند. بیان و فعالیت mmpها ، که در دسته ی پروتئازهای وابسته به روی قرار می گیرند، به شدت توسط مهارگرهای عمومی و اختصاصی کنترل می شود. مهارگرهای ویژه-بافتی mmpها (timps)، با اتصال غیرکوالان و در عین حال محکم به جایگاه فعال mmpها، آن ها را مهار می کنند و به این ترتیب، در تومورهای بدخیم، مانع متاستاز می شوند. تا کنون 4 عضو از این خانواده، در انسان شناسایی شده است. ژن timp-4، با 5 اگزون، رمزکننده ی یک پروتئین 224 اسیدآمینه ای غیرگلیکوزیله است و به صورت اختصاصی در قلب، مغز و بافت چربی بیان می شود. در این پژوهش، دمین عملکردی ژن timp-4 انسانی (حاوی اگزون های 4-1)، به روش soe-pcr تکثیر شده و در سیستم پروکاریوتی e.coli کلون و بیان آن با روش sds-page تأیید شد. موفقیت آمیز بودن soe-pcr این ژن را می توان به عنوان نقطه آغازی برای ایجاد جهش های انتخابی (site-directed mutagenesis) در آن، به منظور افزایش تمایل اتصالی به سوبستراهایش، و یا افزایش اختصاصیت اتصال به یک سوبسترای خاص در نظر گرفت و به این ترتیب، با افزایش فعالیت ضد توموری این پروتئین، آن را به عنوان داروی نوترکیب، برای بهبود برخی از سرطان ها، به ویژه سرطان پستان و سرطان پروستات، به کار گرفت.

از شناخت خواص دارویی و درمانی سم عقرب زمان زیادی می گذرد. هر گونه عقرب می تواند تا بیش از 100 پپتید مختلف داشته باشد. خصوصیات ضد صرعی، ضد سرطانی و حشره کشی سموم عقرب در مقالات مختلف مورد تأیید قرار گرفته است. نوروتوکسین جدیدی با زنجیره کوتاه دارای 36 اسید آمینه و به نام ( (ctxکلروتوکسین از زهر عقرب leiurus quinquestriatus متعلق به خانواده ی buthidae می تواند کانال های یون کلر را مهار کند. در این تحقیق تولید سم کلروتوکسین از پپتیدهای موجود درسم عقرب با تأکید بر خواص ضد متاستازی آن روی سلول های گلیومای بدخیم، به روش مهندسی ژنتیک مورد نظر قرار گرفت. در ابتدا با بررسی توالی های مختلف گزارش شده، پرایمرهای مورد استفاده برای کلروتوکسین طراحی شد و پس از استخراج rna از غدد سم ساز عقرب ایرانی mesobuthus eupeus و سنتز cdna، ژن هدف با pcr تکثیر گردید. قطعه ی مورد نظر با موفقیت در سیستم pet کلون شده و بررسی های بیوانفورماتیکی توالی مورد نظر و مقایسه با دیگر گونه های عقرب که تاکنون مورد بررسی قرار گرفته اند، نشان دهنده تفاوت در توالی آمینواسیدی این پپتید بود. بیان کلروتوکسین در میزبان bl21 با استخراج پروتئین کل و با استفاده از ژل sds-page با غلظت 15? کنترل شد. با توجه به اهمیت سم کلروتوکسین در درمان سرطان های مختلف به خصوص تومورهای دستگاه عصبی، پس از تولید و تخلیص این پپتید می توان آن را در تیمار سلول های سرطانی مورد بررسی قرار داد.

در این پژوهش، ترادف ژنی یک پپتید شبه کلروتوکسین با نام meict، جدا شده از سم عقرب زرد ایرانی، که توسط تیم تحقیقاتی ما در مطالعات قبلی کلونسازی شده بود، مورد مطالعه قرار گرفت و بیان آن در یک میزبان پروکاریوتی بررسی شد. به علاوه جهت پیشگویی عملکرد این پپتید، مطالعات بیوانفورماتیکی نیز صورت گرفت. به منظور تعیین ترادف ژنی meict، ابتدا dna بافت های سرسینه و شکم عقرب استخراج گردید و سپس تکثیر ژن به روش pcr انجام شد. طراحی پرایمر به منظور تکثیر این ژن، به کمک بلاست نوکلئوتیدی و براساس ترادف ژنی پپتیدهای شبه کلروتوکسین صورت پذیرفت. جهت بیان این پپتید، از سیستم بیانی pet استفاده شد. برای انجام این امر، cdnaی کد کننده ی این پپتید، توسط وکتور pet22b(+) به باکتری اشرشیاکلای bl21 به عنوان میزبان انتقال یافت و شرایط مناسب برای القا و بیان آن مهیا گردید. در نهایت به منظور تایید بیان پپتید، از تکنیک وسترن بلات استفاده شد. بررسی های بیوانفورماتیکی و پیشگویی عملکرد این پپتید نیز به کمک نرم افزارهای clc، modeller، cn3d، hex، yasara و mega انجام شد. با وجود تلاش زیاد در تکثیر و تعیین توالی ژنی پپتید meict، در این پژوهش ترادف مورد انتظار برای این ژن به دست نیامد. بررسی ها نشان داده است که کلروتوکسین و بسیاری از پپتیدهای کوتاه زنجیر و بلند زنجیر سم عقرب دارای ساختارهای ژنومی مشابه هستند و از جمله مهم ترین این تشابهات ساختاری، وجود یک اینترون در ناحیه ی کد کننده ی این توکسین ها می باشد. به علاوه آن که توالی ژنی کلروتوکسین و پپتیدهای مشابه، دارای حفاظت شدگی نسبتاً بالایی است. لذا انتظار بر آن است که توالی ژنی meict به عنوان یک پپتید شبه کلروتوکسین، حفاظت شدگی نسبتاً بالایی با کلروتوکسین و سایر پپتیدها داشته باشد. اما در این تحقیق چنین ترادفی حاصل نشد. با این وجود، انجام وسترن بلات، امکان بیان پپتید meict را در باکتری اشرشیاکلای تایید نمود. لذا می توان این پپتید را به صورت نوترکیب در این باکتری بیان نمود و با اهداف تخلیص و بررسی عملکرد و اثرات درمانی مورد استفاده قرار داد. نتایج حاصل از بررسی های بیوانفورماتیکی نیز نشان داد که این پپتید شباهت آمینواسیدی، ساختاری و عملکردی قابل توجهی با کلروتوکسین و پپتیدهای مشابه دارد و لذا می تواند به عنوان یک داروی موثر زیستی جدید در درمان سرطان مورد مطالعه قرار گیرد.

امروزه علم مهندسی پروتئین, دریچه ای نوین برای تولید محصولات زیستی جدید به روی محققان گشوده است. طراحی و ساخت پروتئین های جدید با عملکرد های مورد نظر و همچنین, دستکاری در سایز و ساختار سه بعدی ملکول های پروتئینی با تکنولوژی مهندسی پروتئین امکان پذیر است [1]. از جمله تکنیک های ارزشمند در مهندسی پروتئین, اتصال ژن های مختلف به منظور تولید و بیان ملکول های مرکب حاوی پروتئین های متفاوت است [2]. ساخت بسیاری از پروتئین های هدف یا پلی پپتید های خاص از طریق تکنیک های اتصال ژن که منجر به بیان پروتئین های ترکیبی می شود روندی رو به رشد است. معمولا" پروتئین های ترکیبی خصوصیات عملکردی هر یک از پروتئین های اصلی را دارا هستند [3]. ما در این مطالعه با استفاده از تکنیک های مهندسی ژنتیک بخش های عملکردی دو ژن مهارکننده بافتی ماتریکس متالوپروتئیناز-4 (timp-4) و ژن کد کننده پپتید شبه کلروتوکسین عقرب مزوبوتوس اوپئوس ایرانی (meict) را جهت ساخت یک پروتئین ترکیبی با اهداف درمانی و خواص ضد متاستازی در ساختاری واحد قرار داد ایم. مهار کنندگان بافتی متالوپروتئیناز ها (timps) مهارکنندگان اختصاصی ماتریکس متالوپروتئیناز ها (mmps) بوده, و فعالیت آن ها را در بافت ها کنترل می کنند . ماتریکس خارج سلولی (ecm) بخش پیچیده, پویا و بسیار ضروری همه بافت ها بوده که مهاجرت سلول ها در طی دوره تکوین و مورفوژنز, بهبود زخم ها و بازآرایی بافتی نیازمند تخریب کنترل شده این ماتریکس است [4]. ماتریکس متالوپروتئیناز ها دارای 23 عضو وابسته به روی بوده و اندوپپتیداز ها یی هستند که قادرند تقریبا" تمام اجزای ماتریکس خارج سلولی را تخریب کنند [5]. تحت شرایط فیزیولوژیکی نرمال فعال شدن mmp ها در سطوح مختلف به صورت دقیقی تنظیم می شود [6] و از دست رفتن این کنترل باعث ایجاد بیماری هایی مثل سرطان, بیماری ها ی قلبی-عروقی و ورم مفاصل می شود[7]. خانواده timp در پستانداران 4 عضو (timp1-4) دارد که timp-4 جدید ترین عضو این خانواده است. timp ها دارای یک پایانه انتهایی آمینو 125 اسید آمینه ای و یک پایانه انتهایی کربوکسیلی 65 اسید آمینه ای بوده و هر یک از این قلمرو ها حاوی 3 باند دی سولفیدی حفاظت شده است. پایانه انتهایی آمینو timp-4 تا خورده و به عنوان یک واحد مجزا برای مهار mmpها عمل می کند [8]. در واقع timp از طریق گروه آمینوی اسید آمینه سیستئین در پایانه آمینوی خود, اتم روی (zn)در جایگاه فعال mmp ها را شلاته کرده و از این طریق سبب مهار mmp ها می شود [9]. فعالیت mmp ها برای تهاجم سلول های توموری, شکل گیری متاستاز و رگ زایی نیاز است و بنابراین, مهار آن ها توسط مهارکنندگان طبیعی مثل timp-4 و یا ساخت مهار کنندگان مصنوعی راهی برای مقابله با تهاجم ومتاستاز تومور ها خواهد بود [10]. ژن دیگر مورد نظر در این مطالعه, ژن کد کننده پپتید شبه کلروتوکسین از عقرب مزوبوتوس اوپئوس ایرانی (meict) است. کلروتوکسین اولین بار از سم عقرب لیوروس کوینکواستریاتوس استخراج شد و یک پپتید کوتاه زنجیره 36 اسید آمینه ای است [11]. این پپتید سبب مهار گروهی از کانال های کلر شده و تغییرات گوناکونی را در فیزیولوژی سلول سبب می شود, و شامل 4 پل دی سولفیدی بوده که توسط 8 بنیان سیستئین تشکیل می شود, و از 3 صفحه بتا ویک مارپیچ آلفا تشکیل شده است. کلروتوکسین اولین لیگاند گزارش شده با تمایل بالا به کانال های کلر است که قادر است دریچه های کوچک کلر را ببندد [12]. تحقیقات روی سلول های سرطانی نشان داده که کانال های یونی خاصی در رشد کنترل نشده و تهاجم توموری نقش داشته و مهار کنندگان این کانال ها قادرند رشد تومور را مهار کنند. نقش کانال های کلر و پتاسیم در مورد تومور های مغزی اولیه که سبب تهاجم و متاستاز می شوند ثابت شده است. برای عملکرد تهاجمی سلول های توموری کاهش حجم سلول نیاز است و این امر با خارج شدن آب توسط نیروی شیب الکتروشیمیایی حاصل از کانال های کلر و پتاسیم میسر می شود. کاهش حجم سلول سبب تسهیل تهاجم و متاستاز سلول های سرطانی می شود. بنابراین, مهار کانال های کلر سبب تاخیر در تغییر اندازه سلول شده و تهاجم سلول های توموری را تعدیل می کند. مطالعات اخیر نیز نشان دادند که ماتریکس متالوپروتئیناز-2 (mmp-2) یک رسپتور اختصاصی دیگر برای کلروتوکسین محسوب می شود. mmp-2 پروتئینازی است که در تهاجم توموری درگیر بوده و خصوصا" در گلیوما و سرطان های مربوطه افزایش بیان داشته اما در سلول های نرمال مغز بیان نمی گردد. اتصال کلروتوکسین به mmp-2 مانع از کاهش حجم ابعاد سلول گلیوما شده و قابلیت مهاجرت آن را کاهش می دهد [13]. در این مطالعه ژن کد کننده این پپتید از یک گونه عقرب ایرانی به نام مزوبوتوس اوپئوس انتخاب شده است. بررسی های اولیه توسط دکتر آیت و همکاران در سال 2011 نشان داد که طول cdna کد کننده ی این توکسین، 102 نوکلئوتید بوده و دارای 81% تشابه نوکلئوتیدی با توالی کد کننده ی پپتید ctx می باشد [14]. امید است این پژوهش، گام نخستین برای بررسی های بالینی بعدی و بررسی عملکرد این پروتئین ترکیبی در مهار متاستاز انواع سلول های سرطانی باشد.

در این پژوهش دو کتابخانه آنتی بادی دو ظرفیتی و دو ویژگی vhh-vhh و vhh-vh بر ضد آنتی ژن های توموری رده سلولی skbr3 ساخته شد. این لاین سلولی مارکرهای توموری مربوط به سرطان سینه را بیان می کند، که از جمله آن ها her2 است که بیان بالایی در این لاین سلولی دارد. مارکرهای توموری مولکول هایی هستند که قادرند حضور سرطان را محرز کنند و اطلاعاتی در مورد رفتار بعدی سرطان مثل قابلیت متاستاز و یا پاسخ به درمان فراهم آورند. بعد از کشف آنتی بادی شتری به عنوان آنتی بادیی که عاری از زنجیره سبک است، توجه دانشمندان به سمت این آنتی بادی به عنوان یک وسیله مفید برای تشخیص و درمان بسیاری از بیماری ها جلب شد. مهمترین مزیت دمین متغیر این آنتی-بادی (vhh)، کوچکی و به دنبال آن ایمنی زایی پایین در انسان و قابلیت ردیابی آنتی ژن هایی است که خارج از دسترس دیگر آنتی بادی هاست. مطالعات مختلف نشان داده اند که اشکال دو ظرفیتی و دو ویژگی آنتی بادی تمایل و اختصاصیت بسیار بالاتری برای اتصال به آنتی ژن نسبت به آنتی بادی های تک ظرفیتی دارند. نواحی متغیر زنجیره های سنگین vh و vhh به کمک واکنش pcr، از cdna سنتز شدند. لولای آنتی بادیigg2 و igg3 شتر، به عنوان لینکر برای اتصال vhh به vhh و همچنین اتصال vh به vhh، مورد استفاده قرار گرفتند. دو قطعه آنتی بادی به کمک روش انتقال به وکتور به هم متصل شدند. در ابتدا قطعه vhh-hing به کمک آنزیم برش دهنده sac1 و xho1 به درون وکتور فاژمیدی pcomb3x، انتقال داده شد. در مرحله بعد، قطعات vhh و vh که با کمک آنزیم-های spe1 و xho1 برش داده شدند، به وکتور منتقل شدند. سرانجام وکتور حاوی آنتی بادی دو ظرفیتی و دو ویژگی vhh-hing-vhh و vhh-hing-vh با کمک الکتروپوریشن به درون باکتری الکتروکامپتنت dh5? انتقال داده شد و کتابخانه هایی با بزرگی 105 کلون ساخته شد. همچنین بیان این کتابخانه بررسی شد. به منظور بررسی تنوع کتابخانه های حاضر، بر روی چند نمونه rflp انجام شد. تفاوت در الگوی برش قطعات، نشان دهنده تنوع کتابخانه حاضر است.

متالوتیونین ها خانواده ای از پروتئین های با وزن مولکولی پایین، غنی از سیستئین و جذب کننده ی فلز هستند. این پروتئین ها دارای چندین عملکرد مانند خنثی سازی اثر سمی فلزات، تنظیم همئوستازی فلزات ضروری و جمع آوری رادیکال های آزاد سلولی می باشند. مطالعات نشان داده است که متالوتیونین در فرایندهای تکثیر سلولی و آپوپتوز نیز نقش دارد. متالوتیونین ها پلی پپتیدهای تک رشته ای دارای 61 تا 68 آمینواسید شامل 20 ریشه ی سیستئین حفاظت-شده می باشند. ژنوم یوکاریوت ها دارای چند ژن کدکننده ی متالوتیونین است. خانواده ی متالوتیونین طی وقوع مضاعف شدگی چهار ژن اصلی (mt1 تا mt4) را ایجاد کرده است. mt1 و mt2 در همه ی بافت ها بیان می شوند درحالیکه mt3 و mt4 به ترتیب در بافت مغز و سلول های اپیتلیال بیان دارند. mt3 که فاکتور مهارکننده ی رشد سلول های نورونی (gif) نیز نامیده می شود عملکردهای ویژه ای مانند جلوگیری از جوانه زدن نورون ها دارد و در مغز افراد دچار بیماری آلزایمر کاهش می یابد. در این مطالعه cdnaی متالوتیونین3 موشی جداسازی، توالی یابی و در سیستم پروکاریوتی کلون و بیان گردید. rnaی کل سلول از مغز موش استخراج و خالص سازی شد و سپس جهت ساخت cdna تحت واکنش رونویسی معکوس با استفاده از پرایمر الیگوdt قرار گرفت. orf مربوط به ژن mt3 در وکتور pet22b(+) کلون و به باکتری های اشرشیاکلای سوش top10f و bl21 انتقال داده شد. انجام کلونی-pcr، تعیین توالی و بررسی هم ترازی توالی نشان داد که mt3 به درستی کلون شده است. بیان پروتئین توسط پلاسمید نوترکیب ساخته شده توسط sds-page مورد بررسی قرار گرفت و باند مورد نظر با اندازه ی 9.02 کیلو دالتون مشاهده شد.

vhh(نانوبادی) آنتی بادی یافت شده در سرم شترسانان وکوچک ترین واحد باند شونده به آنتی ژن است. سایزکوچک نانوبادی ها بزرگ ترین مزیت آن ه امی باشدکه به همین سبب دستکاری ژنتیکی آن هاراحت تراست. هدف از انجا م این تحقیق ساخت کتابخانه ی آنتی بادی تک دمین از شتر ایمن شده با یک لاین سلولی آدنوکارسینومای سینه ی انسان (sk-br-3) است. در ابتدا قطعه ی vhh تکثیر شد. vhhدرون پلاسمید pcomb3x کلون شد و پلاسمید نوترکیب به روش الکتروپوریشن وارد باکتری های اشریشیاکولی سوش dh5? شد. تنوع کتابخانه ی تهیه شده توسط تکنیک انگشت نگاری آنزیمی یاrflp مورد بررسی قرار گرفت. هم چنین بیان vhhبا روش sds- pageسنجیده شد. نتایج حاصل از انگشت نگاری آنزیمی نشان دادکه کتابخانه ی آنتی بادی حاصل دارای تنوع می باشد. هم چنین با تکنیک sds-pageمشخص شد که پروتئین vhhبا وزن مولکولی 15 کیلو دالت وندر باکتری های ترنسفورم شده بیان می شود. از آنجایی که sk-br-3لاین سلولی سرطان سینه می باشد ،تهیه ی کتابخانه ی آنتی بادی ایمن بر ضد این سلول ها فرصتی فراهم می کند ت اآنتی بادی های اختصاصی vhhبر ضد آنتی ژن های مختلف سرطان سینه جداسازی شوند. این vhhهابه دلیل سایز کوچک و قدرت نفوذ بالا می توانند کاربرد تشخیصی و درمانی داشته باشند.

ویروس واریسلازوستر vzv عامل دو بیماری آبله مرغان و زونا می باشد. این ویروس بر پایه شباهتهای مورفورلوژیک به همراه ویروس هرپس سیمپلکس یک ‏‎hsv-2, hsv-1‎‏ جز زیر خانواده ‏‎alphaherpesririnae‎‏ قرار گرفته است. عدم وجود مدل حیوانی و تیتر کم ویروس آزاد از سلول باعث شناخت کم از بیولوژی مولکول vzv شده است. تشخیص 1.3 ژنهای vzv و عملکرد آنها از روی شباهتشان با توالی های مشابه در ژنوم ‏‎hsv-1‎‏ صورت گرفته است. مدل ارائه شده برای همانندسازی ‏‎dna‎‏ در vzvاز روی ویروس مشابه آن hsv-1 الگوبرداری شده است. در ویروس hsv-1 هفت ژن لازم برای همانند سازی ‏‎dna‎‏ ویروس پیدا شده اند، تمام این 7 ژن دارای همولوژگ در توالی ژنوم vzv هستند. با این وجود آزمایش مشابه برای پیداکردن ژنهای دخیل در همانند سازی ‏‎vzv dna‎‏ به نتیجه نرسید. علت عدم همانند سازی وابسته به منشا در vzv با بدلیل رخ دادن جهش در پلاسمیدهای سنتزی و غیرفعال شدن آنها بدلیل نیاز به ژنهای دیگر دخیل در همانندسازی می باشد. هدف این تحقیق بررسی بیان ژن کمون شده 52 (جز کمپلکس هلیکاز - پریماز) و اطمینان از بیان و صحت کموناژ آن بود. به این منظور از تکنیک نوین ‏‎dna‎‏ واکسن استفاده شد. در این روش بدنبال تزریق ‏‎dna‎‏ پلاسمیدی به میزبان و بیان آن در مدل حیوان، پاسخ های ایمنی ایجاد می شود. تولید آنتی بادی بر ضد آنتی ژن بیان شده، می تواند حضور پروتئین را در ‏‎invitro‎‏ مشخص کنند.