کلزا یکی از مهمترین گیاهان تولید کننده روغن در جهان می¬باشد. امروزه بهینه¬سازی کاشت، داشت و برداشت این گیاه مورد توجه قرار گرفته است. یکی از مشکلات کاشت کلزا علف¬های هرز و کنترل آنهاست. ازمیان روش¬های مرسوم و موثردر کنترل علف¬های هرز می¬توان به استفاده از علف¬کش¬های قوی با طیف وسیع عمل، نظیر گلایفوسیت، اشاره کرد. گلیفوسیت یک علف¬کش غیر انتخابی با دامنه¬ی عملکرد وسیع می¬باشد که آنزیم 5- انول پیروویل شیکیمات 3- فسفات سنتاز را به طور رقابتی مهار می¬کند. آنزیم epsps یک آنزیم اساسی در ساخت آمینو¬اسیدهای حلقوی در گیاهان، باکتری¬ها و برخی از قارچ¬ها می¬باشد. یکی از موثرترین راه¬های ایجاد گیاهان مقاوم به علف¬کش گلیفوسیت، دست¬ورزی ژن کد کننده¬ی آنزیم 5-انول پیروویل شیکیمات 3-فسفات سنتاز به منظور کاهش تمایل گلیفوسیت به این آنزیم می باشد. در مطالعات گذشته از روش sdm (site directed mutagenesis)برای ایجاد 2 جهش از نوع جانشینی در ژن epsps e. coli انجام شد تا اسید آمینه¬ی گلیسن 96 را به آلانین و آلانین 183 را به ترئونین تبدیل کند. در این تحقیق ژن epsps جهش دار شده به پپتید نشانه کلروپلاستی ژن epsps گیاه کلزا با آغازگرهای هم¬پوشان متصل شد. سپس ژن epsps دستکاری شده در ناقل puc19 و pbi121 همسانه سازی شد. آنالیز¬های ملکولی و نتایج توالی¬یابی نشان داد که ژن به خوبی تغییر یافته است و در هر دو ناقل در جهت مناسبی قرار گرفته است. ناقل بیانی pbi121 حامل ژن از طریق باکتری agrobacterium tumefaciens سویه lba4404و gv3101به گیاه کلزا رقم¬های pf-704591و hyola308 منتقل شد. از انتهای بریده شده برگ¬های لپه¬ای به عنوان بافت هدف جهت انتقال ژن استفاده گردید. گیاه–تکه¬ها به محیط¬های گزینشگر القاء نوساقه، طویل شدن نوساقه و ریشه زایی منتقل شدند. حضور و بیان ژن مورد نظر با آزمون های ملکولی تایید شد.

ژن کیتیناز chis جداشده از bacillus pumilus sg2 دارای سه ناحیه ژنی شامل دامنه کاتالیتیک گلیکوزیل هیدرولاز18، دامنه فیبرونکتین3 و دامنه اتصال به کیتین، به گیاه آرابیدوپسیس منتقل و قابلیت آن در ایجاد مقاومت در برابر بیماری های قارچی مورد ارزیابی قرارگرفت. دو ساختار ژنی شامل توالی کامل ناحیه کدکننده ژن chisو همچنین توالی دامنه کاتالیتیک گلیکوزیل هیدرولاز18(gh18) که با حذف دو دامنه دیگر از ژن chis ایجاد شده بود، بطور جداگانه به گیاهان منتقل شدند. صحت انتقال و ادغام ژن ها توسط آزمون های pcr و سادرن بلات تأیید و نسخه برداری از ژن های انتقالی نیز با روش rt-pcr اثبات شد. بررسی هایelisa و وسترن بلات نشان دادند اکثر لاین های تراریخت که ژن مربوطه را رونویسی کرده بودند پروتئین آن را نیز تولید کرده اند. بررسی آنزیمی نشان داد که با حذف ناحیه اتصال به کیتین، فعالیت کیتینازی پروتئینgh18 در مقایسه باchis تغییری نکرده است. همچنین بررسی های ضد قارچی در شرایط آزمایشگاهی نشان داد با حذف ناحیه اتصال به کیتین فعالیت ضدقارچیgh18 در مقایسه با chis شدیداَ کاهش یافته است. عصاره پروتئینی گیاهان دارای ژنchis توانست رشد قارچ های بیماریزای گیاهی, rhizoctonia solani, sclerotinia sclerotiorum, botrytis cinerea, bipolaris sp., alternaria raphani, alternaria brassicicola, trichoderma reesei, و fusarium graminearum را کنترل کند، در حالی که عصاره پروتئینی گیاهان واجد gh18 تنها رشد هیف های a. brassicicola را به صورت محدود کنترل کرد. همبستگی مثبتی بین میزان بیان پروتئین نوترکیب لاین های تراریخت و اثر بازدارندگی آنها روی رشد قارچ ها مشاهده شد. ارزیابی مقاومت گیاهان کامل نیز نشان داد گیاهان لاین تراریخت achis11 که بیشترین بیان chis را دارا بودند در مقایسه با گیاهان شاهد غیر تراریخت، مقاومت بالاتری در برابر r. solani و a. brassicicola نشان داده و توانستند خسارت بیماری را کاهش دهند. بررسی های مرفولوژیک لاین های تراریخت شده با chis نشان داد در مقایسه با گیاهان شاهد و گیاهان واجد gh18، سرعت رشد، ارتفاع گیاه و طول ریشه در آنها افزایش یافته و سریع تر وارد فاز زایشی شده اند. این تحقیق اولین گزارش از انتقال یک ژن کیتیناز از bacillus pumilus به گیاه می باشد.

گیاهان روغنی بعد از غلات به عنوان دومین منبع تامین کننده کالری برای جوامع بشری محسوب می شوند. گیاه گلرنگ به دلیل داشتن روغنی با کیفیت و محتوای بالای اسید های چرب، در سال های اخیر مورد توجه قرار گرفته است. به منظور بررسی امکان انتقال ژن جهش یافته aro a باکتریایی با واسطهagrobacterium tumefaciens به گلرنگ و بهینه سازی کشت بافت آن، دو آزمایش جداگانه به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار، انجام گرفت. در آزمایش اول، صفات کالوس زایی و باززایی نوساقه ریزنمونه های کوتیلدون و هیپوکوتیل ارقام dincer و سینا در غلظت های مختلف هورمون های naa و bap روی محیط پایه ms، مورد بررسی قرار گرفت. پس از انتخاب بهترین محیط کشت و بهترین ریزنمونه، در آزمایش دوم کارآیی و فراوانی تراریختی ارقام مذکور با سویه های gv3101 و lba4404 اگروباکتریوم در محیط انتخابی حاوی 50 میلی گرم در لیتر کانامایسین مورد ارزیابی گرفت و در نهایت به منظور اطمینان و تأیید تراریختی گیاهان باززا شده، آنالیز pcr با آغازگرهای اختصاصی روی گیاهان انتخابی انجام شد. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که از نظر میزان کالوس زایی و باززایی نوساقه ها بین عوامل اصلی یعنی ارقام، ریزنمونه ها، هورمون naa و هورمون bap اختلاف معنی داری در سطح احتمال یک درصد مشاهده می شود. بررسی اثرات متقابل در خصوص صفات کالوس زایی و باززایی نشان داد که ارقام مورد بررسی در این آزمایش در واکنش به هورمون naa به طور مستقل عمل کرده اند؛ این در حالی است که تا حدودی تحت تاثیر هورمون bap قرار گرفته اند. از طرفی، ارتباط تنگاتنگی نیز بین رقم و نوع ریزنمونه برای صفت کالوس زایی وجود داشته است؛ اما این روند در مورد صفت باززایی مشاهده نشده است. در رابطه با نوع ریزنمونه مشاهده می شود که ریزنمونه ها هم تحت تاثیر هورمون naa و هم هورمون bap قرار گرفته اند. مقایسه میانگین ها برای صفت کالوس زایی نشان داد که بهترین محیط ها برای کالوس زایی ریزنمونه ها که بیشترین درصد تولید کالوس را داشته اند ترکیبات ( bap 0/5 و naa 0/5) و (bap 1 و naa 1) میلی گرم در لیتر به ترتیب با میانگین های 94/33 و 97 درصد بوده است. به علاوه، رقم dincer و ریزنمونه هیپوکوتیل واکنش بهتری را نسبت به کالوس زایی از خود بروز داده اند. در خصوص صفت باززایی، بیشترین درصد باززایی در ترکیب (bap 2 و naa 1/0) به میزان 35/07 درصد و در رقم dincer و ریزنمونه کوتیلدون به دست آمد. نتایج تجزیه واریانس در مورد کارآیی تراریختی نشان داد که اختلاف بسیار معنی داری بین ارقام و سویه های اگروباکتریوم وجود دارد اما اثر متقابل بین این دو عامل غیر معنی دار شده است. در این رابطه، بالاترین درصد باززایی نوساقه های تراریخت در محیط انتخابی مربوط به رقم dincer و سویه lba4404 به میزان 20/61 درصد بوده است. آنالیز pcr گیاهان تراریخت نشان داد که فراوانی تراریختی در رقم dincer، 10 درصد بوده که در مقایسه با میانگین کل تراریختی در محیط انتخابی (قبل از آنالیز pcr) یعنی 16/96 درصد، کاهشی در حدود 7 درصد وجود دارد. به علاوه، تکثیر قطعه bp 1300 (حاصل از آغازگرهای eps1 و eps2) و قطعه bp 1800 (حاصل از آغازگرهای eps2 و 35sf) نشان دهنده حضور این ژن در گیاهان تراریخت رقم dincer می باشد.

مالاریا یکی از مهمترین بیماریهای انگلی در جهان محسوب می گردد. مقاومت انگلهای plasmodium falciparum و plasmodium vivax به داروهای ضد مالاریایی، افزایش مقاومت پشه های آنوفل به حشره کشها، جابجایی جمعیت و تغییرات آب و هوایی، منجر به بازپدیدی مالاریا در جهان شده است. این عوامل نشان دهنده نیاز به تولید یک واکسن مالاریایی موثر در کنار سایر روشهای کنترلی جهت حذف این بیماری می باشند. اگرچه آنتی ژنهای کاندید واکسن متعددی از هر دو گونه p. falciparum و p. vivax شناسایی و ساختار آنها مشخص شده است، اما تولید یک واکسن جهانی موثر هنوز با چالشهای فراوانی روبرو است. یکی از دلایل این امر تنوع آنتی ژنی انگل در مناطق جغرافیایی مختلف است که از عوامل بازدارنده در تولید واکسنهای مالاریایی می باشد. ناحیه انتهای کربوکسیل ژن msp-1 (msp-119) از مهمترین آنتی ژنهای کاندید واکسن مرحله خونی انگل مالاریا در هر دو گونه p. falciparum و p. vivax می باشد. pvmsp-119 و pfmsp-119 جدا شده از انگلهای مناطق مختلف جهان، تنوع آنتی ژنی در توالی اسیدآمینه ای را نشان می دهند در حالیکه چنین اطلاعاتی در مورد ایزوله های ایرانی p. falciparum و p. vivax در دست نمی باشد. بنابراین تعیین میزان پل مورفیسم pvmsp-119 و pfmsp-119 انگلهای منطقه آندمیک مالاریا در ایران امری لازم و ضروری است. جهت بررسی میزان تنوع در ژن کد کننده msp-119 در هر دو گونه، این ژن به ترتیب در 373 (173 نمونه از پارس آباد و 200 نمونه از چابهار) و 150 نمونه از ایزوله های کلینیکی p. vivax و p. falciparum تکثیر شد. در نمونه های pfmsp-119 مورد مطالعه هر دو تیپ آللی (89%) mad20 و (5/6%) k1 مشاهده شد. نتایج تعیین توالی ژن pfmsp-119 در 92 ایزوله، حضور 5 هاپلوتیپ مختلف a1 (e-tsr-l, 20/92)، a2 (q-kng-f, 14/92)، a3 (e-kng-f, 14/92) ، a4 (e-tsg-l, 26/92) و a5 (q-kngl, 18/92) را نشان داد. e-tsg-l، هاپلوتیپ غالب در ایران، قبلاً از تایلند و هند گزارش شده است. از طرفی هاپلوتیپ e-kng-l که شیوع فراوانی در آفریقا، آسیا و آمریکای لاتین دارد، در ایزوله های ایرانی مشاهده نشد. آنالیز تعیین توالی ژن pvmsp-119 در 80 نمونه (60 ایزوله از جنوب و 20 نمونه از شمال غرب) نشان دهنده حفاظت 100% در ایزوله های ایرانی بود. نتایج این مطالعه مبنی بر حفاظت بسیار زیاد در ژن pvmsp-119 و تنوع ژنتیکی محدود در ژن pfmsp-119 نشان می دهد که می توان از هر دو آنتی ژن pvmsp-119 و pfmsp-119 در طراحی واکسن پلی والانت منطقه ای استفاده نمود. علاوه بر این، مطالعات ایمونواپیدمیولوژی در مناطق مختلف آندمیک مالاریا با میزان انتقال و ژنتیک انسانی متفاوت، اطلاعات مهمی را در درک پاسخ های ایمنی میزبان به p. vivax و p. falciparum فراهم می کند که می تواند در طراحی واکسن موثر علیه این گونه ها مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین هدف دوم از این مطالعه، ارزیابی پاسخ آنتی بادی طبیعی به آنتی ژنهای نوترکیب pvmsp-119 و pfmsp-119 در بیماران مبتلا به p. vivax و یا p. falciparum منطقه هیپوآندمیک ایران جهت درک و فهم از برخورد متقابل انگل و میزبان به منظور تولید واکسن بر پایه msp-119 بود. در این مطالعه، وضعیت زیرکلاسهای igg و اویدیتی آنها نسبت به پروتئینهای rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119 در افراد منطقه آندمیک مالاریا در چابهار که بطور طبیعی در معرض انگلهای (94 = n) p. vivax و (92 = n) p. falciparum قرار دارند، ارزیابی شد. در افراد آلوده به عفونت فعال p. vivax و p. falciparum، به ترتیب 1/86% و 8/72% دارای آنتی بادی igg علیه rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119 بوده و igg1 زیرکلاس غالب علیه هر دو آنتی ژن (9/81%) rpvmsp-119 و (5/78%)rgst-pfmsp-119 بود. علاوه بر این، جهت تعیین پایداری آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119، فراوانی این آنتی بادیها در افرادی از گروه عفونت فعال ویواکسی (74 = n) و فالسیپارومی (14 = n)، پس از درمان استاندارد با کلروکین ارزیابی شد. نتایج نشان داد که فراوانی آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به ترتیب به 3/51%، 51% و 2/16% (pvmsp-119) و 4/71%، 2/64% و 1/14% (pfmsp-119) کاهش یافت. اویدیتی آنتی بادیهای igg ضد pvmsp-119 در نمونه های سرمی مثبت اندازه گیری شد و نتایج نشان دهنده اویدیتی بالای آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به ترتیب در 6/66%، 61% و 47% از افراد آلوده به عفونت فعال p. vivax بود. در حالیکه اویدیتی بالای آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به ترتیب در 7/62%، 75/50% و 62/47% از افراد آلوده به عفونت فعال p. falciparum یافت شد. این نتایج نشان می دهد که افراد در معرض مالاریای ویواکسی و فالسیپارومی در منطقه آندمیک مالاریای ایران، آنتی بادیهایی با اویدیتی بالا علیه rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119 تولید می کنند. این اطلاعات در درک بهتر واکنشهای متقابل میزبان و انگلهای p. vivax و یا p. falciparum جهت توسعه واکسن ساخته شده بر پایه msp-119 در مناطق آندمیک کمک خواهد کرد. در بیماری مالاریا، آنتی بادیها و سلولهای t نقش مهمی را در حفاظت علیه عفونتهای p. vivax و p. falciparum به عهده دارند. البته قابل ذکر است که ایمن سازی با msp-119 نوترکیب منجر به ایجاد ایمنی محافظت کننده نسبی از طریق آنتی بادیها می شود. بنابراین، سومین هدف این تحقیق، بررسی میزان افزایش یا کاهش پاسخ های ایمنی در موشهای ایمن شده با دو آنتی ژن به صورت ترکیبی که در یک محل تزریق شده اند و با استفاده از استراتژیهای مختلف می باشد. نتایج نشان داد که موشهای ایمن شده با دو آنتی ژن نوترکیب به تنهایی و یا به صورت ترکیبی با استفاده از روش prime-boost هتروژن (تزریق prime با µg 100 از dna و boost با µg 35 از پروتئین نوترکیب) سبب القاء تولید میزان قابل توجهی از آنتی بادیهای igg1،igg2a و igg2b (مخلوطی از پاسخ th1/th2) می شود که با روش elisa اندازه گیری شدند. همچنین هر دو آنتی ژن سبب القاء افزایش تولید ifn-? و il-10 در موشهای ایمن شده گشتند. استفاده از مخلوط دو آنتی ژن نوترکیب به روش prime-boost، پاسخ آنتی بادی، ifn-? و il-10 مشابهی در مقایسه با استفاده از هر یک از این آنتی ژنها به تنهایی با این روش القاء نمود. بنابراین مطالعه حاضر استراتژی جدید استفاده از تزریق دو آنتی ژن در یک جایگاه را جهت توسعه واکسنهای مرحله خونی مالاریا پیشنهاد و معرفی می کند. در نهایت می توان نتیجه گرفت که ناحیه انتهایی کربوکسیل پروتئین pv/pfmsp-119 را می توان در طراحی واکسن پلی والانت علیه هر دو گونه در این منطقه ازجهان استفاده نمود.

علف کش گلایفوسیت به صورت وسیع الطیف و غیر انتخابی در کنترل علفهای هرز مزارع کلزا (brassica napus l.) ، که از مهم ترین گیاهان دانه روغنی جهان به شمار می رود، بسیار موثر می باشد و اثرات بازدارندگی خود را بر روی علفهای هرز و گیاه زراعی، از طریق مهار رقابتی آنزیم کلیدی 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthaseیا epsps در مسیر شیکیمات اعمال می نماید. از راهکارهای موجود برای ایجاد مقاومت به علف کش گلایفوسیت استفاده از آنزیم epsps جهش یافته درگیاه هدف می باشد. در این راستا، دو جهش(a183t, g96a) در ژن epsps جداشده از منبع باکتریایی e. coli 4610 توسط روش جهش زایی نقطه ای mutagenesis) (site direct، ایجاد شده و در گیاه زراعی کلزا تحت پروموتر camv 35s بیان یافته اند. در این پژوهش، از بذور گیاهان t2 برای تولید و آنالیز نسل سوم گیاهان تراریخت استفاده شد. مقاومت به علف کش گلایفوسیت در گیاهچه ها و قطعات محور زیر لپه مورد بررسی قرار گرفت و تحمل گیاهچه ها در غلظت های 1/0 تا 2/0 میلی مولار علف کش و توسعه کالوس در غلظت 05/0 میلی مولار مشاهده شد . حضور و بیان ژن های جهش یافته epsps در این گیاهان با آزمون های pcr ، rt-pcr، و elisa اثبات گردیده و نتایج حاصله بیانگر ایجاد گیاهان تراریخت با میزان مقاومت پایدار نسبت به علف کش گلایفوسیت بودند. در نهایت، محلول پاشی گیاهان تراریخت گلدانی با غلظت های مختلف علف کش صورت گرفت که مشاهدات حاکی از تحمل این گیاهان در دامنه ای حدود 5-5/2 میلی مولار از علف کش و مقاومت نسبی در غلظت 10 میلی مولار در هر دو نوع از لاین های مورد بررسی بود. البته گیاه تراریخت دارای ساختار ژنی با جهش g96a در مقایسه با گیاه تراریخت داری ساختار ژنی با جهش a183t ، درجات بالاتری از مقاومت را نشان داده که می تواند حاکی از پایداری بیشتر و کارآیی بهتر این نوع جهش، بیان موثرتر آن در سطوح مختلف نسخه برداری و ترجمه ونیز جایگزینی مناسب تر آن در طی فرآیند تراریختی باشد. .

باکتری اشریشیا کولی انتروتوکسیژنیک، عامل اصلی اسهال در کودکان زیر 5 سال در کشورهای در حال توسعه است. آنتی ژن عامل کلونیزاسیون i (cfa/i) و توکسین حساس به حرارت (lt) از عوامل مهم حدت زای باکتری محسوب و به عنوان کاندیدای واکسن نیز مطرح می شوند. گیاهان تراریخت از طریق خوراکی می توانند ملکولهای کاندیداهای واکسن را به سطوح مخاطی گوارشی برسانند و پاسخهای ایمنی مخاطی و عمومی را تحریک کنند. ژن زیر واحد اصلی آنتی ژن عامل کلونیزاسیون (cfab) و زیر واحد b توکسین حساس به حرارت جهت بیان در گیاه، بهینه سازی و سنتز شد. ژن cfab-ltb در وکتورهای pbi121 (با پروموتر عمومی) و pbi1400 (با پروموتر اختصاصی دانه کلزا) زیر همسانه سازی و از طریق آگروباکتریوم تومی فاشینس به ترتیب به گیاه توتون و گیاه کلزا منتقل گردید. با استفاده ازتکنیک pcr و ساترن بلات حضور ژن در گیاه تراریخت و با تکنیک rt-pcr بیان ژن بررسی شد.. با روش ایمونوبلات سنتز پروتئین cfab-ltb دربرگ گیاه تنباکو و دانه گیاه کلزا تایید شد. میزان بیان فیوژن پروتئین cfab-ltb در برگ گیاه تراریخت تنباکو و دانه کلزا در حدود 3/0% پروتئین محلول تام برآورد شد. موشها با برگ توتون و دانه کلزا تراریخت از راه خوراکی ایمن شدند. وجود آنتی بادی igg و iga علیه ltb و cfab در سرم و مدفوع موشهای واکسینه، نشان دهنده تحریک پاسخهای ایمنی مخاطی و عمومی متعاقب واکسیناسیون است. همچنین آنتی بادی موشهای ایمن، از اتصال سم lt به رسپتور gm1 و اتصال باکتری etec به سلول caco-2 ممانعت می کرد. موشهای ایمن، با باکتری etec از راه خوراکی مواجه شدند و در مقایسه با موشهای کنترل، علایم بیماری و مرگ و میر در آنها دیده نشد. به عنوان نتیجه می توان گفت که فیوژن پروتئینcfab-ltb بیان شده در برگ تنباکو و دانه کلزا هنگامی از راه خوراکی به موشها تجویز می شود می تواند ایمونوژن و حفاظت بخش باشد و به عنوان کاندیدای واکسن علیه باکتری etec مطرح شود.

چکیده: انگلهای تک یاخته جنس لیشمانیا طیف وسیعی از عفونت ها را با شدت بیماریزایی متفاوت در انسان ایجاد می کنند که از زخمهای پوستی بهبود یافته تا بیماریهای احشایی بسیار شدید را در بر می گیرد. علی رغم تلاشهای بسیار هنوز کنترل بیماری میسر نگردیده است. در تمام سلولهای زنده اعم از سلولهای پروکاریوت و یوکاریوت پروتئینهای ترشحی معمولاً بصورت پروتئینهای پیش ساز که دارای یک توالی پپتید نشانه در انتهای آمینی خود هستند ساخته می شوند که پروتئینهای تازه ساخته شده را به مقصد نهایی در پری پلاسم، غشاء خارجی یا محیط خارج سلولی هدایت می کند. این پپتید پس از انتقال پروتئین از غشاء یا در طی عمل انتقال توسط آنزیم پپتیداز نشانه signal peptidase (spase) حذف می گردد. این آنزیم برای حیات باکتریها ضروری می باشد. لیشمانیا یک انگل تک سلولی و دیپلوئید بوده که دارای یک نسخه از ژن spase i است. در این تحقیق عملکرد و نقش آنزیم spase i در لیشمانیا ماژور برای نخستین بار تحت بررسی قرار گرفت و تلاش شد تا ژن مذکور به روش نوترکیبی مشابه حذف و اثرات آن بر روی حیات، رشد و تمایز انگل در دو حالت پروماستیگوت و اماستیگوت، تمایز انگل و خاصیت عفونت زایی آن در شرایطin vitro و in vivo بررسی شود. به منظور از هم گسیختن ژن spase i از طریق نوترکیبی مشابه، دو ساختار پلاسمیدی px63-neo و px63-hyg که حاوی دو ژن مقاومت به آنتی بیوتیک های نئومایسین (g418) و هیگرومایسین b هستند، استفاده شد. دو ناحیه بالا دست ((5?flanking=5?f و پایین دست ((3?flanking=3?f ژن spase i با روش pcr از ژنوم لیشمانیا ماژور جدا و در دو طرف ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک کلون گردید. بخشی از ساختار ناقل نوترکیب که در بر گیرنده ژن مقاومت به همراه دو ناحیه 5?f و 3?f بود با آنزیمهای محدود الاثر از ناقل جدا و تخلیص شد. در مرحله نخست ترانس فکشن، قطعه 5?f-neo-3?f از طریق الکتروپوریشن به درون انگل تیپ وحشی لیشمانیا ماژور وارد و در داخل ژنوم الحاق گردید. انتخاب انگلهای هتروزیگوت ?spase::neo/spase بر اساس مقاومت به آنتی بیوتیک g418 و بر روی محیط کشت نیمه جامد آگار دار صورت گرفت. در مرحله دوم ترانس فکشن، برای حذف آلل دوم ژن spase i ، از قطعه 5?f-hyg-3?f استفاده شد. غربال گری انگلهای هموزیگوت بر روی محیط کشت آگار دار حاوی دو آنتی بیوتیک g418 و هیگرومایسین b انجام شد. اما عدم رشد انگل نشان می دهد که احتمالاً حذف هر دو آلل در انگل لیشمانیا ماژور امکان پذیر نیست. برای بدست آوردن انگل هتروزیگوت ?spase::hyg/spase انگل های تیپ وحشی با قطعه 5?f-hyg-3?f ترانس فکت شدند و انگلهای هتروزیگوت مقاوم به آنتی بیوتیک هیگرومایسین b بر روی محیط کشت آگاردار بدست آمد. اما این انگلها در محیط مایع نسبت به هیگرومایسین b حساسیت بالایی از خود نشان دادند. نتایج pcr و ساترن بلات انگلهای جهش یافته هتروزیگوت ?spase::neo/spase و ?spase::hyg/spase به وضوح نشان داد که ژنهای هر دو آنتی بیوتیک در جایگاه لوکوس ژنspase i جایگزین شده است. همچنین آزمونهای وسترن بلات و rt-pcr نشان داده اند که آنزیم پپتیداز نشانه در انگلهای هتروزیگوت ?spase::neo/spase بیان می گردد. مشاهدات میکروسکوپی انگلهای جهش یافته هتروزیگوت ?spase::neo/spase حاکی از آن است که این انگل ها دچار تغییر در شکل ظاهر شده اند. بطوریکه اندازه آنها به یک سوم اندازه انگل تیپ وحشی رسیده و تا حدودی از تحرک آنها کاسته شده است. بررسی قدرت بیماری زایی انگلهای هتروزیگوت ?spase::neo/spase نشان داد که این انگلها در مقایسه با انگل تیپ وحشی قادر به ایجاد عفونت در کف پای موشهای حساس balb/c نیستند. این انگلها در درون بافتهای مختلف طحال، غدد لنفاوی و کف پای موشهای آلوده در مقایسه با انگل تیپ وحشی از پایداری کمتری برخورداراند. بطوریکه در زمانهای مختلف (از 1-12 روز) پس از تزریق، انگل زنده در بافت کف پای کشت داده شده مشاهده نگردید. نتایج real-time pcr از بافتهای مختلف موشهای آلوده به روشنی نشان داد که بقاء انگل هتروزیگوت در بافتهای مختلف از جمله کف پای موشهای آلوده به طور قابل ملاحظه ای کاهش یافته است. نتایج کسب شده از آزمون in vitro با استفاده از ماکروفاژهای آلوده و in vivo کاهش چشمگیر قدرت بیماری زایی انگلهای هتروزیگوت را نسبت به انگلهای تیپ وحشی آشکار می کند. نتایج این مطالعه این فرضیه را قوت می بخشد که احتمالاً انگلهای هتروزیگوت توان تمایز و یا تکثیر در درون سلول را تا حد زیادی از دست داده اند. اطلاعات بدست آمده از این تحقیق که برای نخستین بار گزارش شده است بطور خلاصه عبارتند از: 1- spase i یک ژن ضروری و حیاتی برای شکل پروماستیگوت انگل است. بطوریکه حذف هر دو آلل آن امکان پذیر نیست. 2- حضور این آنزیم احتمالاً در تمایز شکل پروماستیگوت به اماستیگوت حائز اهمیت است. 3- بیان این پروتئین در تکثیر، بقاء و پایداری انگل در درون ماکروفاژ ها در شرایط in vitro از اهمیت خاصی برخوردار است. 4- فعالیت آنزیم پپتیداز نشانه در ایجاد عفونت در بدن موشهای حساس balb/c الزامی است.

ویروس های آنفلوانزای پرندگان تهدید جدی برای سلامت انسان و حیوان به شمار می روند. تحت تیپ های ویروس های تیپ a براساس خاصیت آنتی ژنی دو گلیکوپروتئین سطحی، هماگلوتینین (ha) و نورآمینیداز (na) تعیین می شوند. تاکنون 16 زیرواحد ha و 9 زیرواحد na در این ویروس ها شناسایی شده اند. آزمایش های سرمی متداول برای تعیین آنتی بادی علیه ویروس آنفلوانزای پرندگان، آزمایش ممانعت از هماگلوتیناسیون (hi) و الایزا هستند. آزمایش hi روش استاندارد برای تعیین تحت تیپ ویروس آنفلوانزا در تمام گونه های پرندگان است اما تولید آنتی سرم به ویژه زمانی که ویروس فوق حاد است بسیار خطرناک خواهد بود. با استفاده از کیت های الایزا آنتی بادی اختصاصی پروتئین های داخلی npو m که در همه ویروس های آنفلوانزا به شدت حفاظت شده اند، بدون تعیین تحت تیپ قابل تشخیص هستند. آنتی سرم مورد استفاده در آزمایش hi ممکن است دارای آنتی بادی های همسان na یک جدایه نامعلوم ویروس آنفلوانزا باشد. در این صورت آنتی بادی علیه na به طور غیراختصاصی با ha مداخله می کند. این مساله می تواند به بازدارندگی غیراختصاصی و تعیین هویت اشتباه جدایه منجر شود. بهینه سازی تشخیص سولوژی تحت تیپ های ویروس آنفلوانزا، ژن کامل ha و زیر واحد ha1 جدایه اخیر تحت تیپ h9n2 در وکتور باکولوویروس بیان شده و مقادیر مناسبی پروتتین نوترکیب طی کشت شناور سلول های sf9 بدست آمد. پروتئین های نوترکیب به عنوان آنتی ژن در طراحی آزمایش الایزا برای تشخیص تحت تیپ h9n2 و تفکیک آن از سایر تحت تیپ های ویروس آنفلوانزای پرندگان، و نیز ایمن سازی جوجه های spf برای تهیه آنتی سرم اختصاصی استفاده شدند. حساسیت و ویژگی سیستم های طراحی شده با آزمایش 92 نمونه سرم طیور و مقایسه نتایج با آزمایش hi و کیت تجاری الایزا بررسی شدند. داده های حاصل نشان داد که آزمایش های طراحی شده هم خوانی نزدیکی با هم دارند اما rha1-elisa حساسیت بیش تری نسبت به hi دارد. مزیت سیستم rha1-elisa، عدم واکنش متقاطع با سایر تحت تیپ های ویروس آنفلوانزا است.

باکتری زانتوموناس کمپستریس xanthomonas campestris))، باکتری تولید کننده صمغ زانتان می باشد. زانتان یک پلیمر خارج سلولی است که در صنایع غذایی و صنایع نفت کاربردهای فراوانی به عنوان ویسکوز کننده و امولسیون کننده دارد. از آنجا که این باکتری به طور طبیعی قادر به مصرف لاکتوز نیست؛ زانتان نمی تواند از محیط های پایه حاوی لاکتوز نظیر آب پنیر ( پساب صنعتی ارزان قیمت) تولید شود. به منظور حل این مشکل، اوپرون لاکتوز از باکتری e. coli به وسیله یک مشتق ترانسپوزونی mini mu ( mud ii 1681) به باکتری x. campestris pv campestris 1706 منتقل شد. این ترانسپوزون در داخل ژنوم یک پلاسمید جای داده شده است که حاوی ژن های lacz,y,a در یک مجموعه ژنی و ژن نشانگر کانامایسین می باشد (pbci, 16.5kb). پس از تراریختی xcc با استفاده از روش استاندارد الکتروپوریشن و پلاسمید pbci، mudii به طور تصادفی و به روش ترانسپوزیشن وارد ژنوم xanthomonas می شود. سلول های تراریخت شده xccاز محیط انتخابی حاوی کانامایسین و محیط های پایه حاوی لاکتوز ( به عنوان منبع کربن) جداسازی شدند. dna ژنومی باکتری های تراریخت جداسازی شده و به عنوان الگو جهت تکثیر ژن های اختصاصی 16s rdna ( به منظور اطمینان از جنس باکتری تراریخت شده) و lacz ( به منظور اطمینان از ورود ژن خارجی به ژنوم) به کار رفت. با هدف تایید صحت انجام کار، محصولات pcr از دوجهت تعیین توالی شدند. به علاوه، در این پژوهش میزان رشد ( منحنی رشد) و تولید زانتان از چند کلنی تراریخت نیز در مقایسه با باکتری استاندارد x . campestris pv campestris dsmz 1706 بر روی محیط های مایع حاوی لاکتوز ( به عنوان تنها منبع کربن) بررسی شد. نتایج به دست آمده نشان داد که باکتری های نوترکیب نه تنها می توانند روی محیط های حاوی لاکتوز رشد کنند، بلکه قادر به تولید پلیمر زانتان نیز از این محیط ها می باشند. بررسی ها برای تعیین تعداد نسخه های ژن وارد شده نیز حاکی از آن بود که دست کم یک نسخه ژنی وارد ژنوم باکتری شده است. در ادامه، سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز و میزان مصرف لاکتوز محیط نیز تائید نمود که فعالیت بتاگالاکتوزیدازی، دست کم 6 برابر وتوان هیدرولیز قند لاکتوز در باکتری های تراریخت، دست کم در حدود دو تا سه برابر سویه استاندارد می باشد.

اشریشیاکلی سویه o157:h7 یکی از مهمترین پاتوژن های غذایی تولید کننده بیماری کولیت خونریزی دهنده و ادرار خونی در انسان می باشد. دام های اهلی اصلی ترین مخزن این باکتری بوده و بکارگیری واکسن بر علیه آن یکی از مهمترین را ههای پیشگیری این باکتری می باشد. پروتئین های intimin و espa دو فاکتورمهم بیماریزایی و کلونیزاسیون این باکتری دراپیتلیوم روده میزبان به حساب می آیند که توسط ژن های موجود در جزیره پاتوژنسیته lee تولید می شوند. پروتئین espa بخش اصلی از پروتئین هایی است که در ساخت کانال ارتباطی در سیستم ترشحی نوع iii نقش داشته و مانند یک رابط سبب انتقال پروتئین tir به سلول میزبان می شود ( در اینجا انسان) و در نهایت پروتئین intimin با اتصال به tir منجر به اتصال باکتری به سلول میزبان می شود. این اتصال باعث ایجاد ضایعه تخریب دیواره سلول یا ae میزبان می گردد فرضیه انجام تحقیق بر این اصل است که تولید عوامل بیماریزای espa;intimin به صورت کایمریک به عنوان کاندیدای واکسن خوراکی می تواند کلونیزاسیون ecolio157h7 را در حیوان مدل کاهش دهد. برای این منظور یک سازه ژنی حاوی قسمت های ایمونوژن espa (e) و eae (i) با استفاده از یک رابط پپتیدی با ساختار ?- هلیکس به یکدیگر متصل و ژن آن به طور مصنوعی ساخته شد. این ژن مصنوعی براساس کدون های (رمزهای) میزبان گیاه بهینه سازی و سپس با استفاده از پیش بر camv35s جهت بیان درون گیاه تنباکو درون ناقل بیانی گیاه کلون شد. ساختار ایجاد شده به کمک آگروباکتری به درون گیاه انتقال داده شد. بر اساس آنالیز های انجام شده توسط الالیزای کمی مشخص شد که پروتئین کایمریک درون برگ گیاه تنباکو به طور متوسط 3/0 درصد از پروتئین محلول گیاه (tsp) را تشکیل می دهد. کاربرد گیاهان ترانسژن حاوی این ایمونوژن دو گانه می تواند ابزار مناسبی برای محافظت در برابر حضور و بیماریزایی باکتری e. coli o157:h7 در مدل حیوانی باشد. ?

بیماری تب خونریزی دهنده کریمه –کنگو (cchf) عفونت ویروسی کشنده ای با 50% مرگ و میر است که از طروق گزش کنه، خون و ترشحات آلوده دام وازراه تنفس به انسان سرایت می کند و عامل آن ویروسی از خانواده bunyaviridae و جنس nairovirus است. ویروس cchf دارای ژنوم rna تک رشته ای سه قطعه ای مشتمل بر قطعات s ، m ، l می باشد.قطعه s در حدود 1200 نوکئوتید نوکلئوکپسید، قطعه m در حدود 5100 نوکئوتید گلیکوپروتئین ویروس و قطعه l در حدود 12000 نوکئوتید نوعی پلیمراز را رمز می کنند. در این طرح تحقیقی مصمم شدیم که گلیکوپروتئین ویروس تب خونریزی دهنده کریمه-کنگو پس از بهینه سازی کدونی در مدل گیاهی بیان نموده و پس از حصول اطمینان از تراریختی و بیان آنتی ژن مورد نظر، چالش ایمنولوژیکی آن را در مدل حیوانی بررسی نمائیم. پس از آنالیزهای تائیدی گیاهان تراریخت مبنی بر بیان گلیکوپروتئین g1/g2 ، برگ گیاه تنباکو و بذر گیاه کلزا با دو راهبرد خوراکی و خوراکی/تزریقی برای ایمنی زایی موشهای آزمایشگاهی استفاده شدند. گروه موشهایی که واکسن تزریقی cchf که برای تزریق انسانی موجود می باشد بصورت تزریقی دریافت نمودند به عنوان شاهد مثبت و گروهی که گیاه غیر تراریخت را که فاقد گلیکوپروتئین می باشد دریافت نکردند شاهد منفی می باشند. لازم به ذکر است که گلیکوپروتئین g1/g2 با روش آگروفیلتراسیون در برگ گیاه تنباکو بیان و با روش کروماتوگرافی میل ترکیبی تخلیص گردید و بعنوان آنتی ژن در تزریق به موشها و آزمونهای الایزا و وسترن بلات استفاده گردید. تمام موشهای ایمن افزایش قابل توجهی از آنتی بادی های igg و iga را به ترتیب در سرم و مدفوع نشان دادند. موشهای خوراکی/تزریقی بعد از دریافت وعده تزریقی آخر از گلیکوپروتئین g1/g2 تخلیص یافته از گیاه، افزایش چشمگیری در آنتی بادی igg سرم نشان دادند. همانطورکه نتایج نشان می دهند ایمنی زایی موشها با گیاهان تراریخت به روش خوراکی امکان پذیر بوده و لذا ارزیابی های بعدی نظیر بررسی ایمنی زایی در دامها، بررسی ایمنی سلولی، انجام تست خنثی سازی ویروسی در آزمایشگاههای سطح 4 ایمنی زیستی برای ارزیابی چالش و سنجش گلیکانهای گلیکوپروتئین g1/g2 تولید شده در گیاه در مراحل بعدی در دست انجام می باشد.

زانتان یک پلی‏ساکارید خارج سلولی تولید شده توسط باکتری‏های جنس xanthomonas است که به دلیل ویسکوزیته بالا و دیگر خواص منحصر به فردش به عنوان عامل غلیظ کننده و سوسپانس کننده در صنایع مختلف غذایی، دارویی، شیمیایی و نفت کاربرد دارد. به دلیل پایین بودن سطح فعالیت آنزیم بتا‏گالاکتوزیداز در این باکتری‏ها و عدم رشد کافی در محیط پایه‏ای لاکتوز، امکان تولید صمغ زانتان در مقیاس وسیع صنعتی و با استفاده از منابع ارزان قیمتی مثل آب پنیر میسر نمی‏باشد. در این پژوهش، مطالعاتی روی کلکسیونی متشکل از 210 سویه ایرانی xanthomonas. citri subsp. citri (xci) صورت گرفت که در میان آن‏ها تعدادی از سویه‏های لاکتوز مثبت شناسایی شدند. این سویه‏ها قادرند علاوه بر محیط پایه لاکتوزی، روی محیط آب پنیر نیز رشد نموده و تولید زانتان نمایند. به دنبال غربالگری این سویه‏ها، تلاش گردید تا با استفاده از روش کار مولکولی و تعیین سکانس ژن 16s rdna این باکتری‏ها و تطابق آن با دیگر توالی‏های 16s rdna باکتری‏های زانتوموناس موجود در gene bank، از جنسیت این باکتری‏ها اطمینان حاصل شود. همچنین، با استفاده از روش‏های بیوشیمیایی، آنزیم بتا‏گالاکتوزیداز تولیدی توسط این باکتری‏ها مورد ارزیابی قرار گرفت که در تعدادی از سویه‏ها فعالیت آنزیمی بسیار بالایی دیده شد. نتایج بدست آمده نشان می‏دهد که در مقایسه با سویه تجاری، میزان و کیفیت زانتان تولیدی توسط سویه‏های بومی از مطلوبیت و مقبولیت بیشتری برخوردار است.در این پروژه کلکسیون باکتری های xanthomonas citri (در پژوهشگاه مهندسی ژنتیک و زیست فناوری) از نظر قدرت رشد بر روی محیط های واجد قند لاکتوز به عنوان تنها منبع کربن مورد بررسی قرار می گیرد. ارزیابی حضور ، میزان و کارایی آنزیم در استفاده از این قند و در نهایت تولید زانتان در سویه های منتخب بررسی خواهد شد. امید می رود که سویه های xanthomonas citri با توانایی بالا در تولید انزیم و استفاده از منبع لاکتوز انتخاب و برای مراحل بعدی (به کارگیری آب پنیر) مورد استفاده قرار گیرد

اشریشیاکلی سویه o157:h7 یکی از مهمترین پاتوژن های تولید کننده بیماری کولیت خونریزی دهنده در انسان می باشد. دام های اهلی اصلی ترین مخزن این باکتری بوده و بکارگیری واکسن بر علیه آن یکی از مهمترین را ه های پیشگیری این باکتری می باشد. پروتئین های intimin، tir و espa مهمترین فاکتورهای بیماریزایی این باکتری به حساب می آیند که توسط ژن های جزیره پاتوژنسیته lee تولید می شوند. پروتئین espa از پروتئین هایی است که در ساخت کانال ارتباطی در سیستم ترشحی نوع iii نقش داشته و مانند یک رابط سبب انتقال پروتئین tir به سلول میزبان می شود و در نهایت پروتئین intimin با اتصال به tir اتصال محکم و اختصاصی باکتری به سلول میزبان را سبب می شود. این اتصال باعث ایجاد ضایعه تخریب دیواره سلول یا a/e میزبان می گردد. فرضیه انجام تحقیق بر این اصل است که تولید دو عامل بیماریزا از سه مورد فوق به صورت کایمریک و به عنوان یک ایمونوژن خوراکی می تواند با تحریک مناسب سیستم ایمنی میزبان مانع کلونیزاسیون باکتری e. coli o157:h7 در حیوان شود. برای این منظور یک سازه ژنی حاوی قسمت های ایمنی زایeae (i) وtir (t) با استفاده از یک رابط پپتیدی به یکدیگر متصل و ژن آن به طور مصنوعی ساخته شد. این ژن مصنوعی براساس کدون های گیاه بهینه سازی و سپس تحت کنترل پروموتر camv35s در ناقل بیانی گیاه جهت بیان درون گیاه تنباکو کلون شد. در نهایت این گیاهان تراریخت حاوی این ایمونوژن دو گانه جهت بررسی ایمنی زایی به حیوان مدل به صورت خوراکی داده شد و سپس خون حیوان برای بررسی انتی بادی های تولید شده تحت آنالیزهای مولکولی قرار گرفت.

هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b، نوعی باکتری گرم منفی کپسولدار است و یکی از شایع ترین عوامل مولد مننژیت حاد بشمار می آید. کپسول پلی ساکاریدی این باکتری ؛پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (prp )و پروتئین غشاء خارجی p6 به عنوان ایمونوژن در تولید واکسن علیه هموفیلوس آنفلوانزا نقش دارند .هدف از انجام این مطالعه ، کونژوگه نمودن پروتئین نوترکیب p6(rp6 ) با prp و ارزیابی ایمونولوژیک آن به عنوان کاندیدای جدید واکسیناسیون در مدل موشی است. به این منظور، prp پس از کشت انبوه سویه استاندارد هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b(atcc 10211 ) در فرمانتور 50 لیتری ، تولید و تخلیص گردید. ژن p6 نیز در سیستم pet28a(+) ، کلون و در میزبان e.coli bl21 بیان شد و پروتئین نوترکیب p6پس از تخلیص ، با prp بصورت کونژوگه در آمد. گروههای موشی balb/cبطور جداگانه بصورت داخل صفاقی با کونژوگه prp-rp6 ، prp، rp6و مخلوط prp+rp6 ایمن گردیدند . عیار igm و igg اختصاصی علیه آنتی ژنهای مذکور در نمونه های سرم جمع آوری شده در روزهای 14 و 28 اندازه گیری شد. سطوح اینترلوکین 4 و اینترفرون گاما نیز در کشت لنفوسیتهای موشهای ایمن شده مورد سنجش قرارگرفت. اثرات حفاظتی هریک از آنتی ژنها هم پس از چالش موشهای ایمن با سویه بیماریزای هموفیلوس آنفلوانزا بررسی گردید . در نتیجه کشت انبوه هموفیلوس آنفلوانزا در فرمانتور 50 لیتری ، prp با غلظت تقریبی 790 میلی گرم بر لیتر جداسازی شد. ژن p6 نیز با موفقیت در وکتور pet28a(+) کلون و در e.coli bl21 بیان گردید که در نتیجه آن ، rp6 با بازدهی بالا و بمیزان تقریبی 50 میلی گرم از هر لیتر محیط کشت تخلیص شد. rp6 و prpبترتیب با راندمان 52 و 38 درصد بایکدیگر کونژوگه گردید.عیار igm و igg تام علیه کونژوگه prp-rp6 در روز 28 افزایش معنی داری داشت (05/0p<) . مقادیر igg1 و il-4 نیز در موشهای ایمن شده با کونژوگه فوق ، بترتیب افزایش معنی داری نسبت به igg2a و ifn-? داشت(05/0p<) . پس از چالش ، بقای موشهای ایمن شده با کونژوگه prp-rp6 نیز در مقایسه با سایر گروههای موشی ، افزایش معنی داری نشان داد(05/0p<) . نتایج این مطالعه نشان می دهد که کونژوگه prp-rp6 می تواند پاسخهای مناسب ایمنی اختصاصی علیه هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b را القاء نماید و بیانگر آن است که پاسخهای ایمنی هومورال ، نقش عمده ای در محافظت موشها دربرابر عفونتهای سیستمیک ناشی از هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b ایفاء می نماید.

فناوری گیاهان ترانسپلاستومیک جایگاه مهمی در مطالعات علوم پایه و زیست فناوری دارد. دست ورزی ژنتیکی ژنوم پلاستیدی به ویژه ژنوم کلروپلاست، مزایای متعددی نظیر بیان بالا، توانائی بیان ژن های چندگانه و عدم انتقال ناخواسته ژن خارجی توسط دانه گرده را فراهم نموده است. با توجه به این ویژگی ها، علاقه زیادی برای به کارگیری این سیستم ها جهت مصارف کشاورزی، صنعتی و پزشکی وجود دارد. یکی ازکاربرد های این فناوری متحمل سازی گیاهان با ارزش زراعی به علف کش ها یی نظیر گلایفوسیت است. گلایفوسیت از جمله علف کش های غیر انتخابی است که از طریق غیر فعال کردن آنزیم 5- انول پیروویل شیکیمات 3- فسفات سنتاز(epsps) در مسیر شیکیمات مانع سنتز اسیدهای آمینه حلقوی ودرنهایت موجب مرگ گیاه می گردد. از مطالعات پیشین، ژن دست ورزی شده epsps که در ساختار آن دو جهش ایجاد شده و به گلایفوسیت تحمل نشان می دهد، موجود می باشد. در این طرح از ماهیت پروکاریوتی کلروپلاست و توانایی آن در بیان mrna های پلی سیسترونی به منظور تولید هم زمان چند پروتئین نوترکیب استفاده شد. از طریق تعبیه ی توالی داخلی اتصال ریبوزوم (internal ribosome entry site,ires)، ژن epsps جهش یافته ی باکتریایی و متحمل به گلایفوسیت در ناقل کلروپلاستی pkcz و در کنار ژن aada (ژن مقاومت به آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین و استرپتومایسین) قرار گرفت. به این ترتیب یک ساختار اوپرونی و تحت کنترل پروموتر prrn16 ساخته شد.به منظور ارزیابی عملکرد mrna بلند حاصل در ترجمه پروتئین های مربوطه، دو سازه ژنی دی سیسترونیک تهیه شد. در یکی از سازه ها، ژن epsps در بالادست ژن aada همسانه سازی گردید و در دیگری در پایین دست آن قرار گرفت. تراریختی کلروپلاست ها با این دو سازه به روش زیست پرتابی و بر روی گیاه توتون انجام گرفت. به منظور دست یابی به گیاه تراریخت هموپلاسم، مراحل متعدد باززایی روی محیط انتخابی انجام شد. با آنالیزهای مولکولی بر روی گیاهان حاصل، حضور ژن های موجود در سازه در کلروپلاست این گیاهان مورد تأیید قرار گرفت. ارزیابی فنوتیپی گیاهان t0 با پاشیدن گلایفوسیت بر روی گیاهان تراریخت و گیاه تیپ وحشی به عنوان شاهد، انجام شد. نتایج حاصل، القا تحمل به علف کش تا سطح بیش از 0/2 میلی مولار را نشان داد که چهار برابر دوز کشنده برای نمونه غیر تراریخت است. برای به دست آوردن حد آستانه تحمل به گلایفوسیت در گیاه تراریخت لازم است غلظت های بالاتر علف کش بر روی گیاه اعمال گردد و تحمل گیاه ارزیابی شود.

متحمل سازی گیاهان زراعی نسبت به علف کش گلیفوسیت از طریق دست ورزی های ژنتیکی یکی از کاراترین روش های موجود در کنترل علف های هرز مزارع محسوب می شود. گلیفوسیت با مهار آنزیم epsps (5-انول پیرویل شیکیمات-3-فسفات سنتاز) در مسیر شیکیمات مانع سنتز اسید های آمینه حلقوی و در نتیجه مرگ گیاه می شود. برای توسعه گیاه با سطح تحمل قابل قبول در مقیاس تجاری، علاوه بر دست ورزی آنزیم epsps، به کار گیری ژن-های مربوط به آنزیم های تجزیه کننده گلیفوسیت نظیر gox (گلیفوسیت اکسیدورداکتاز) نیز ضروری می باشد. این آنزیم علف کش را به ترکیب آمینومتیل فسفونیک اسید (ampa) و گلی اکسالات که اثر کشندگی کمتری برای گیاه دارند تبدیل می کند. این ژن برای اولین بار از باکتری خاک زیochrobactrum antrophi سویه lbaa جدا شده است. در تحقیق حاضر، از خاک های باغات مناطق مختلف ایران با سابقه استفاده از علف کش گلیفوسیت نمونه برداری شده است و با روش های غنی سازی، باکتری هایی که قادر به رشد در محیط حاوی 3 میلی مولار گلیفوسیت به عنوان تنها منبع فسفات بودند، غربال شدند. مسیر تجزیه در باکتری مربوط به جنسochrobactrum با روش hplc مورد بررسی قرار گرفت و ترکیبampa به عنوان ماده حدواسط شناسایی شد. این باکتری می تواند کاندید مناسبی برای تجزیه زیستی گلیفوسیت نیز باشد. لذا، براساس توالی ژن gox ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ncbi، آغازگرهای اختصاصی طراحی گردید و تلاش شد تا با انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز این ژن از باکتری های مذکور جداسازی گردد. با توجه به اینکه محصول تکثیر یافته پس از هم ردیفی با توالی ژن gox همسانی نداشت، لذا، ژن آن به طور مصنوعی ساخته شد. در این راستا، با کمک نرم افزارهای مختلف رایانه ای برای افزایش کارایی بیان ژن در گیاه، رمزهای ژن gox متناسب با گیاه brassica napus l. بهینه سازی گردید. همچنین درصد gc آن کاهش داده شد، عناصر تنظیمی منفی کاهش و توالی های مفید شامل کوزاک برای افزایش دقت ترجمه در آن تعبیه شد. ژن مصنوعی در ناقل بیانی گیاه (pbi121) همسانه سازی شد و برای تراریختی گیاهان کلزا در جهت ارزیابی اثر آن در مقاومت به گلیفوسیت به کار گرفته شد. پس از باززایی گیاهچه های تراریخت شده، نمونه ها در آزمایشگاه با روش کمی رقابتی زنجیره ای پلیمراز(qc-pcr) مورد بررسی قرار گرفتند و تعداد نسخه تراژن در 9 لاین مختلف تراریخت سنجیده شد. مقایسه نتایج بدست آمده با روش دورگه سازی سادرن در حدود 89 درصد شباهت را نشان داد و داده ها تنها برای یک لاین متفاوت بود. همچنین با روش کمی رقابتی rt-pcr، میزان بیان mrna در نه لاین مذکور اندازه گیری شد. نتایج بدست آمده نشان داد که لاین های 4، 7، 9 و 12بیشترین بیان را نشان دادند. در عین حال، بررسی فنوتیپی گیاهان t1 با پاشش گلیفوسیت بر روی گیاهان تراریخت و گیاه تیپ وحشی به عنوان شاهد، انجام شد. نتایج حاصل نشان دادند که گیاهان تراریخت، علف کش گلیفوسیت را تا سطح 5/1 میلی مولار تحمل می-نمایند. گرچه این میزان در حد محصولات تراریخت تجاری شده نیست، ولی بکارگیری این ژن در کنار ژن epsps مقاوم (با جهش های دوگانه) امکان ایجاد مقاومت در حد بالاتری را برای اهداف تجاری سازی کلزای تراریخت فراهم خواهد کرد.

چکیده اشریشیاکلی سویه o157:h7 یکی از عوامل بیماری زایی مهم انسان و دام می باشد. اتصال باکتری به سلول میزبان، اولین گام در تثبیت و بیماری زایی است که به واسطه سیستم ترشحی نوعiii صورت می گیرد. در این میان espa به عنوان اصلی ترین جزء تشکیل دهنده سیستم ترشحی ارتباط تنگاتنگی با اتصال اولیه ی باکتری به سلول میزبان دارد. . espa به سبب ساختار خود و قرار گرفتن آن در غشاء خارجی باکتری، یک ایمنی زای قوی می باشد. tirنیز پروتئینی است که پس از بیان در باکتری و از طریق سیستم ترشحی نوعiii به سلول میزبان منتقل و در غشاء آن مستقر می شود و نقش مهمی در اتصال باکتری به میزبان دارد. سیستم های بیان گیاهی به دلیل هزینه ی پایین تولید، انجام تغییرات پس از ترجمه ای مشابه سایر سلول های یوکاریوتی، تشکیل ساختار صحیح پروتئین تولیدی و عدم آلودگی محصولات به عوامل بیماری زای انسانی، توالی های سرطان زا، پریون ها، جایگزینی مناسب برای سیستم های بیانی مرسوم محسوب می شوند. بیان آنتی ژن عوامل بیماری زایی میکروبی و ویروسی در گیاهان جهت تولید واکسن های خوراکی مطلوبیت ویژه ای دارند. به ویژه اینکه سلول های گیاهی به عنوان میکروکپسول های طبیعی از آنتی ژن های واکسن هنگام عبور از دستگاه گوارش محافظت می کنند. پروتئین های ایمونوژنیک کلیدی عوامل بیماری زا می توانند در بافت های گیاهی بیان شده و به عنوان واکسن خوراکی به انسان یا حیوانات ارزشمند اقتصادی خورانده شود. دریافت دهانی واکسن به دلیل هزینه کمتر و انجام ساده تر جایگزین جذاب و مناسبی برای تزریق می باشد. همچنین شانس دست یافتن به ایمنی مخاطی علیه عوامل عفونی که از این سطوح وارد می شوند با دریافت دهانی افزایش می یابد. در این تحقیق برای تهیه ی سازه ی ژنی حاوی قسمت های ایمنی زایespa(e) وtir(t) که با استفاده از یک رابط پپتیدی به یکدیگر متصل شده بودند از روش soeing pcr استفاده گردید. این ژن مصنوعی براساس کدون های گیاه بهینه سازی شد. در ادامه سازه ی فوق جهت همسانه سازی به ناقل pjet منتقل گردید. پس از اطمینان از صحت همسانه سازی از طریق توالی یابی، سازه ی دوتایی et جایگزین ژن gus در ناقل بیانی گیاهی شد و تحت کنترل پیشبرنده دائمی camv 35s قرار گرفت. سپس ساختار تهیه شده به agrobacterium tumefaciens وارد گردید و از آن برای تراریختی ریز نمونه های توتون استفاده گردید. پس از دو روز هم کشتی توام با اگروباکتریوم روی محیط هم کشتی، ریز نمونه ها به محیط باززایی انتخابی حاوی کانامایسین منتقل شدند.شاخساره های باززایی شده با اندازه ی مناسب به محیط ریشه زایی انتقال یافتند. تائید تراریختی گیاه با آزمون pcr و با آغازگر های اختصاصی صورت گرفت. برای تائید بیان ژن کایمریک et،در سطح رونویسی از آزمون rt-pcr استفاده شد.

چکیده: اسینتوباکتر بامانی عامل مهم عفونت های بیمارستانی است. مشکل پیش روی درمان در این باکتری، گزارشات روز افزون از مقاومت به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها، از جمله کرباپنم ها است. آنزیم های کرباپنمازی اگزاسیلینازها ((oxa-type، متالوبتالاکتامازها(mbls) و نوعی بتالاکتاماز وسیع الطیف (ges)، از عوامل اصلی مقاومت به کرباپنم ها هستند. هدف این مطالعه تشخیص مولکولی اسنیتوباکتر بامانی و ژن های مقاومت به کرباپنم ها و تیپ بندی ژنتیکی ایزوله های اسنیتوباکتر بامانی مقاوم به کرباپنم ها به روش mlva می باشد. ایزوله های بالینی با روش های بیوشیمیایی تا حد جنس و با روش pcr، گونه اسینتوباکتر بامانی شناسایی شد. الگوی حساسیت میکروبی وmic برای ایمی پنم و مروپنم به روش دیسک دیفیوژن و آگار دایلوشن انجام شد. ژن های مقاومت به کرباپنم ها ges, oxa-type, vim, imp و اینتگرون ها را با پرایمرهای اختصاصی به روش pcr بررسی و با استفاده از پرایمرهای ترکیبی عناصر الحاقی بالادست ژن های اگزاسیلیناز شناسایی گردید. تیپ بندی ژنومی ایزوله های مقاوم به کرباپنم باروش multiple-locus vntr analysis typing انجام شد. از 131 اسینتوباکتر، 123 ایزوله (9/93%) دارا ی ژن oxa-51 bla بودند که به عنوان اسینتوباکتر بامانی شناسایی شدند. درصد مقاومت این ایزوله ها به آنتی بیوتیک های ایمی پنم و مروپنم به ترتیب 5/54% و 7/83% بود. mic50 در نمونه های مقاوم به ایمی پنم برابر با 64 میکروگرم در میلی لیتر و در نمونه ها ی مقاوم به مروپنم برابر با 32 میکروگرم در میلی لیتر بود. 8/87% ایزوله ها دارای ژن ,bla oxa-238/13% حاوی ژن bla oxa-24 و6/1% حامل ژن bla oxa-58 بودند. 3/29% سویه ها حاوی عنصر الحاقی یک دربالادست ژن blaoxa-51، 2/96% حامل isaba-1در بالادست blaox-a23 بودند. 9/30% دارای ژن blavim و 6 نمونه دارای ژن blaimp، یک نمونه حامل ژن blages بود. 9/34% سویه به طور همزمان حامل اینتگرون کلاس 1و 2 و 3/59% سویه ها فقط حامل اینتگرون کلاس 1 بودند. شاخص تنوع (diversity index) روش mlva برای ایزوله های مقاوم به کرباپنم 96/0بود، که قدرت تفکیک discriminatory power)) بالای این روش را نشان می دهد. هفت کمپلکس کلونال و 25 سینگلتون مشاهده شد که 6/38% نمونه ها در کمپلکس کلونال 1 قرار داشتند. نتایج این تحقیق نشان می دهد که ایزوله های مقاوم به کرباپنم اسینتوباکتر بامانی در دو بیمارستان مورد بررسی دارای الگوی ژنوتیپی تقریبا یکسان بودند و bla oxa-23شیوع بالایی داشت. استفاده فزاینده از کرباپنم ها در درمان، احتمالا فشار انتخابی برای ایزوله های مقاوم است.

لژیونلا پنوموفیلا یکی از عوامل مهم مواردتک گیری و همه گیری پنومونی های کسب شده از جامعه و بیمارستان می باشد. مطالعات اولیه نشان داده است که واکسن های کارآمد ممکن است به کنترل بیماری لژیونر کمک کند و از بروز موارد اپیدمیک جلوگیری نماید. امروزه مشاهده شده است که آنتی-ژن های چندگانه نه تنها ایمونوژنیسیتی آنتی ژن را بالا می برند بلکه باعث تحریک پاسخ های ایمنی زایی متعدد می شوند. در این پژوهش برای افزایش ایمنی متقاطع پروتئین های نوترکیب، فیوژن پروتئین flapal شامل پروتئین فلاژلین fla)) و پروتئین مرتبط با پپتیدوگلیکان pal)) که از فاکتورهای بیماری زا و از آنتی ژن های بسیار مهم باکتری هستند، ساخته و پاسخ های ایمنی محافظت کننده آن در مدل موش balb/c بررسی گردید. ژنهای کدکننده آنها از ژنوم لژیونلا پنوموفیلا سویه paris و با پرایمرهای اختصاصی طراحی شده با روشpcr تکثیر شده و به منظور بیان در سیستم پروکاریوتیک (e.coli) در پلاسمیدpet28a(+) به عنوان وکتور بیانی ساب کلون و با استفاده از روش های مولکولی تأیید گردید. با استفاده از هضم آنزیمی، قطعه ژنی flaa در وکتور حاوی ژن pal جای داده شد و ژن فیوژن تعیین ترادف گردید. پروتئین های نوترکیب مربوط به ژن ها درe.coli سویه bl21(de3) بیان و واکنش پذیری ایمنی پروتئین های نوترکیب توسط وسترن بلات پس از خالص سازی به روش کروماتوگرافی میل پیوندی با رزین نیکل مورد تأیید قرار گرفت. پاسخ های ایمنی هومورال و سلولی به فیوژن پروتئین نوترکیب و هر یک از پروتئین ها به طور جداگانه، مخلوط و کنترل های مناسب و همچنین قدرت حفاظت بخشی آنها در مواجهه با لژیونلا پنوموفیلا با روش کشت لنفوسیت های طحال و ارزیابی تولید سیتوکاین در سرم بررسی و بقا در موش های balb/c مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین-های نوترکیب در حیوانات ایمن شده باعث تحریک قابل توجه پاسخ های ایمنی گردیدند. تولید آنتی بادی igg2a و igg2b به ترتیب در میانکنش با پروتئین نوترکیب pal و fla در گروه ایمن شده با پروتئین فیوژن نوترکیب در مقایسه با هریک از گروه های دریافت کننده این پروتئین ها به تنهایی در سطح معنی داری دیده شد (p<0.05). ارزیابی طیف سایتوکاینی پاسخ های th1/th2 بیانگر پاسخ سلولی چشمگیر نسبت به آنتی ژن های نوترکیب در گروه ایمن شده با پروتئین فیوژن نوترکیب قبل از چالش و باکتری لژیونلا پنوموفیلا بعد از چالش بود. به طوریکه ایمن سازی با این پروتئین منجر به ایمنی حفاظت بخش در چالش با باکتری شدکه با تکثیر سلول های طحالی، تولید ifn? و tnf? در سرم و بقای %100موش ها مشاهده گردید.

بیماری اسهال از معضلات مهم بهداشت جهانی برای جوامع انسانی و سیستم های پرورش صنعتی دام محسوب می شود. از مجموعه عوامل بیماری زا، باکتری های روده ای نقش مهمی در ایجاد این بیماری ها دارند. از میان سموم تولید شده توسط این باکتری ها، سم حساس به حرارت (lt) باکتری اشریشیا کلی مولد سم روده ای (etec)، سم کلرا (ctx) باکتری ویبریو کلرا و سم شیگا باکتری اشریشیا کلی خونریزی دهنده روده ای (ehec) که به ترتیب عامل ایجاد اسهال مسافرتی، اسهال آبکی و اسهال خونی و غیر خونی می باشند، به عنوان عوامل جدی ایجاد عفونت های روده ای در کشورهای در حال توسعه شناخته می شوند. این سموم به خانواده ab5 تعلق دارند که در آن ها زیرواحد b مسئول اتصال سم به سطح سلول میزبان و تسهیل ورود بخش فعال سم به داخل سلول می باشد. مطالعات گذشته حاکی از آن است که مصرف زیرواحد b به صورت خوراکی می تواند سیستم ایمنی را به خوبی تحریک کرده و میزبان را علیه کل سم ایمن نماید. بنابراین برای استفاده به عنوان قسمتی از یک واکسن خوراکی مناسب می باشد. ریشه های مویین گیاهان رآکتور زیستی مناسبی برای تولید ایمونوژن های نوترکیب محسوب می شوند. در این تحقیق تولید ریشه های مویین با کمک اگروباکتریم رایزوژنز در گیاهان توتون و کلزا به منظور تولید پروتئین های کایمریک lsc (متشکل از زیرواحدهای ltb-stxb-ctxb) و sc (متشکل از زیرواحدهای stxb-ctxb) القا شدند. پس از تأیید تراریختی ریشه های مویین با روش pcr، میزان پروتئین نوترکیب تولید شده در ریشه های مویین توتون و کلزا به ترتیب معادل 05/0% و 08/0% کل پروتئین محلول گیاه تعیین گردید. به منظور ایجاد ایمنی در مدل حیوانی (به روش تزریقی) پروتئین stxb نیز در میزبان e. coli bl21(de3) تحت کنترل پروموتر t7 بیان شد. پروتئین نوترکیب تولید شده سپس به روش کروماتوگرافی میل ترکیبی تخلیص شد. میزان پروتئین تولید شده حدود 76 میلی گرم در یک لیتر محیط کشت تخمین زده شد. نتایج این تحقیق بیان گر کارایی بالای سیستم ریشه های مویین برای تولید پروتئین های نوترکیب می باشد.

سرطان سینه شایع ترین سرطان در میان زنان در جهان است. یکی از روش ها برای تشخیص سرطان سینه شناسایی نشانگرهای مرتبط به تومور است. موسین1 (muc1)، یک آنتی ژن مرتبط به تومور، گلیکوپروتئین غشایی است که توسط سلولهای اپی تلیال طبیعی بیان می شود و توسط کارسینوماهای با منشاء اپی تلیال بیانش افزایش می یابد. همچنین گیرنده فاکتور رشد اپیدرمال-2 (her2/erbb-2) متعلق به یکی از چهار عضو خانواده تیروزین کیناز نوع یک است که بیان بیش از حد آن با درجه بدخیمی سرطان سینه همراه است. این مطالعه به منظور تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی و طراحی یک پروتئین کایمریک نوترکیب حاوی آنتی ژن هایmuc1 وher2 برای بیان در میزبان پروکاریوتی e. coli)) به عنوان ابزار تشخیص سرطان پستان انجام شد.توالی های ایمنوژنیکmuc1 وher2 استخراج شد و توسط لینکر به یکدیگر متصل شدند. ساختار کایمریک توسط نرم افزارهای بیوانفورماتیک تجزیه و تحلیل شد. بهینه سازی، خالص سازی و ارزیابی بیان پروتئین کایمریک با استفاده از روش های وسترن بلات، الایزای غیر مستقیمi-elisa) ) و ایمونوهیستوشیمی (ihc) انجام شد. نتایج نشان دادند که ساختار کایمریک، دارای پایداری مناسب و دومین های ایمونوژن که در معرض قرار گرفته اند. وکتورpet-28a حاوی ژن کایمریک، بیان در سطح بالایی داشته است. پروتئین کایمریک نوترکیب با استفاده از وسترن بلات تایید شد و با استفاده از روش هایi-elisa و ihc مورد ارزیابی قرار گرفت.پس از آن پپتیدهای ترکیبی muc1 و her2، می توانند به عنوان آنتی ژن های پوششی در i-elisa برای تشخیص آنتی بادی ها بر علیه muc1 یا her2 در سرم انسانی مورد استفاده قرار گیرند.

ترکیبات فنلی که به طور مرتب در نتیجه فعالیت های شهری و صنعتی تولید می شوند می توانند در اثر فعالیت آنزیمهایی مانند لاکازها به طور کامل سمزدایی شده یا به ترکیباتی با سمیت کمتر زیست پالایی شوند. هدف از تحقیق حاضر بیان القایی آنزیم لاکاز تنها در صورت مواجهه با ترکیبات آلاینده و سپس نمایش سطحی این آنزیم بر سطح سلولهای e. coli است تا دسترسی مناسبی میان آنزیم و سوبسترا به وجود آید. فاکتور فعال کننده رونویسی capr قادر است پروموتر القا شونده po را در حضور آلودگیها راه اندازی کند. در این مطالعه ژن لاکاز مقاوم به حرارت به سیستم نمایش سطحی aida-i متصل شده و پایین دست پروموتر po قرار داده شده است. نتایج نشان می دهد که در حضور غلظتهای مختلف فنل بیان لاکاز انجام می شود. همچنین وسترن بلات حضور آنزیم لاکاز تنها در غشای خارجی را تایید نمود. فعالیت آنزیم بر روی سطح سلولها نیز مورد سنجش قرار گرفت تا تاخوردگی صحیح آنزیم پس از عبور از خلال غشا بررسی شود. لاکاز نمایش داده شده بر روی سطح قادر به اکسیداسیون سوبسترای syringaldazin (sgz) و فنل موجود در محیط کشت می باشد. نتایج آزمون hplc نشان دهنده کاهش چشمگیر میزان فنل موجود در محیط کشت سلولهایی است که لاکاز را بر سطح خود نمایش داده اند.

باکتری enterotoxigenic escherichia coli مهمترین عامل اسهال مسافران و یکی از شایعترین عوامل اسهال در کودکان زیر 5 سال در کشورهای درحال توسعه می باشد. مهمترین عوامل بیماریزایی این باکتری، فاکتورهای کلونیزه کننده و سموم روده ای lt و st می باشند. تا کنون واکسنهای متعددی برای پیشگیری از عفونت etec ارائه شده اند که واکسنهای زیرواحدی از جمله آنها می باشند. در تحقیق حاضر یک واکسن کاندید زیرواحدی طراحی و بیان شده و کارایی آن از نظر القاء ایمنی و نیز مصونیت زایی در حیوان مدل موش مورد بررسی قرار گرفت. در ترکیب این کاندید واکسن، پروتئینهای زیرواحدی فاکتورهای کلونیزه کننده cfa/i و cs6 که شامل پروتئینهای cfab (برای cfa/i) و cssa و cssb (برای cs6) هستند، استفاده شده اند. مشارکت سموم روده ای در ساختار واکسن کاندید منوط به از بین بردن سمیت آنها می باشد. به همین دلیل در مورد سم lt زیرواحد b آن (ltb) که فاقد ویژگی سمی است و یک ادجوانت بالقوه محسوب می شود در ترکیب واکسن کاندید بکار برده شد. سم st علاوه بر سمی بودن، به دلیل کوچک بودن اندازه، توان ایمنی زایی پایینی دارد. بنابراین در این مطالعه با تغییر در ترکیب آمینواسیدی st، ویژگی سمی آن از میان رفته و برای افزایش توان ایمنی زایی اش، توالی st به صورت یک اپی توپ در داخل توالی پروتئین cfab وارد شد. اجزای واکسن کاندید از طریق رابطهای پپتیدی بهم متصل شدند و ویژگیهای مختلف ترکیب کایمریک با آنالیزهای بیوانفورماتیکی بررسی شدند. پروتئین کایمریک و نیز اجزای آن بصورت مستقل در میزبان پروکاریوتی بیان و تخلیص شدند و برای ایمن کردن حیوانات بکار رفتند. بررسی سرم حیوانات ایمن شده حاکی از القاء ایمنی هومورال از نوع igg و iga بر علیه پروتئین کایمریک بود. این سرم در آزمون ایمونوبلات قادر به شناسایی تک تک زیرواحدها بوده و در آزمون بچه موش شیرخوار نیز توانست سم st را خنثی نماید. همچنین ایمنی شکل گرفته برعلیه پروتئین کایمریک در بدن حیوانات ایمن شده آنها را در برابر دز کشنده باکتری بیماریزای etec حفاظت کرد. این پروتئین ترکیبی با اعمال تغییراتی می تواند به عنوان یک کاندید واکسن برای باکتری etec مطرح شود.

چکیده: با توجه به اهمیت غذایی کلزا(brassica napus l.) به عنوان یکی از مهمترین گیاهان تولید کننده روغن در جهان، امروزه بهینه سازی کاشت، داشت و برداشت این گیاه مورد توجه بسیار قرار گرفته است. حضور علف هرز در مزارع کلزا سبب کاهش قابل توجه محصول این گیاه می شود. علف کش گلیفوسیت به صورت وسیع الطیف و غیر انتخابی از طریق مهار رقابتی آنزیم کلیدی5-enolpyruvylshikimat-3-phosphate synthase یا epsps در مسیر شیکیمات، اثرات بازدارندگی خود را بر روی علف هرز و گیاه زراعی اعمال می کند. از راهکارهای موجود برای ایجاد مقاومت به علف کش گلایفوسیت استفاده از آنزیم های epsps جهش یافته و از جمله جهش زایی در جایگاه a183t و g96a می باشد. در عین حال از دیگر راه کارهای ایجاد کننده مقاومت به علف کش گلایفوسیت می توان به آنزیم گلایفوسیت اکسیدورداکتاز یا gox اشاره نمود که از طریق تجزیه گلایفوسیت به ترکیب بی اثر آمینومتیل فسفونیک اسید (ampa) و گلی اکسالات عمل می کند. در این تحقیق،کاست های ژنی epsps جهش دار و ژن goxهم به صورت مستقل و هم در کنار هم تحت کنترل پروموترcamv35s و پپتید نشانه کلروپلاستی در ناقل دوتایی pbi121 همسانه سازی شده و سپس از طریق agrobacterium tumefaciens سویه lba4404 به گیاه کلزا منتقل شدند. با توجه به نگرانی های موجود در مورد استفاده از انتخابگرهای آنتی بیوتیکی، به صورت همزمان از دو نوع ناقل دوتایی استفاده شد که یک نوع دارای ژن مقاوت به کاناماسین و دیگری فاقد این ژن بود. به همین منظور از گلایفوسیت به عنوان نشانگر انتخابی استفاده شد. آنالیز مولکولی لاین های تراریخت به دست آمده از طریق pcr و rt-pcr حاکی از تلفیق و بیان تراژن های مذکور بود. در عین حال، آزمون جوانه زنی بذور t1 روی محیط های حاوی غلظت های مختلف از گلایفوسیت بیانگر بروز مقاومت نسبی در لاین های بیان کننده دو کاست ژنی در مقایسه با لاین های تک ژنی بود. با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق می توان استفاده هم زمان از دو مکانیسم بروز مقاومت به علف کش گلایفوسیت را جهت ارتقاء سطح مقاومت در گیاهان مهم واستراتژیک و به خصوص کلزا پیشنهاد داد.

چکیده آنزیم های تجزیه کننده زایلان توسط انواعی از باکتریهای هوازی و بی هوازی و قارچ ها تولید می شود که جهت تجزیه بافت های گیاهی و آزاد سازی زایلوز به عنوان منبع اصلی کربن در متابولیسم سلولی و یا برای عفونت زایی در سلول های گیاهی از طریق تجزیه همی سلولز به این آنزیم ها نیاز دارند. آنزیم های تجزیه کننده زایلان به علت کاربرد گسترده شان در فرایندهای صنعتی مانند بهبود قابلیت هضم غذای دام و طیور، سفید سازی کاغذ، صنایع نساجی، تولید زایلو الیگوساکاریدها، بهبود بافت در صنایع نانوایی، شفاف سازی آبمیوه ها، حذف پوست دانه گیاهان، تبدیل پساب های لیگنوسلولز به فراورده های واجد ارزش اقتصادی مانند اتانول، پروتئین تک سلولی، عصاره های قندی و سوخت های زیستی توجه فراوانی را به خود جلب نموده است. در این میان مخمرها به دلیل سهولت تولید صنعتی و نیز سمیت کمتر، ارزش بیشتری برای کاربرد در صنایع غذایی دارند. در این پژوهش، در مجموع 110 جدایه مخمری از 20 نمونه از منابع گوناگون شامل پساب کارخانجات کاغذ سازی، خاک، گل ها، سبزیجات و پوست درختان جداسازی شد و نیم رخ آنزیمی این جدایه ها تعیین شد و علاوه بر جدایه های مولد زایلاناز، سویه های مخمری واجد بالاترین فعالیت آنزیمی در هر گروه شناسایی شد. شناسایی جدایه واجد بالاترین فعالیت نوکلئازی به معرفی تاکسون جدیدی با نام basidioascus persicus منجر شد. فعالیت زایلانازی خارج سلولی بر اساس تشکیل هاله شفاف بر روی پلیت زایلان آگار تعیین شد. جدایه مولد بیشترین میزان آنزیم زایلاناز برای بهینه سازی فرایند تولید با استفاده از روش های کلاسیک (یک عامل در هر زمان) و آماری (پلاکت- بورمن و سطح پاسخ) انتخاب شد. در این پژوهش 11 جدایه واجد فعالیت زایلانازی جداسازی شدند. جدایه واجد بالاترین فعالیت زایلانازی تحت عنوان aureobasidium pullulans سویه sn090 شناسایی شد. این جدایه علاوه بر فعالیت بتا 1و 4 زایلانازی قادر به تولید بتا زایلوزیداز (iu/ml 179/0) و آلفا آرابینوفورانوزیداز (iu/ml 063/0) نیز می باشد. بر اساس روش کلاسیک بهینه سازی، گرماگذاری به مدت 48 ساعت در دمای c? 27، اینوکولوم 2%، ph آغازین 4 و سرعت همزنی rpm 90 شرایط بهینه برای دستیابی به حداکثر تولید آنزیم تعیین شد. پسماندهای کشاورزی واجد زایلان به عنوان منبع کربن جایگزین ارزان قیمت برای تولید زایلاناز مورد بررسی قرار گرفتند. بازده تولید آنزیم زایلاناز در محیط کشت واجد سبوس گندم به عنوان تنها منبع کربن بسیار به میزان تولید در محیط واجد زایلان خالص شباهت داشت. در طراحی آزمایش به روش پلاکت- بورمن برای غربالگری عوامل موثر و روش طراحی ccd برای بهینه سازی تولید آنزیم بکار رفت. سرعت هوادهی، غلظت منبع کربن (w/v) و ph آغازین به عنوان عوامل موثر توسط روش پلاکت بورمن انتخاب شد. در مقایسه با محیط بهینه سازی نشده، فعالیت زایلانازی iu/ml 52/5 در محیط بهینه سازی شده به روش ccd بدست آمد و در نتیجه افزایش 09/2 برابر پس از بهینه سازی محیط کشت حاصل شد. در مرحله بعد، خالص سازی آنزیم به روش الکتروفورز sds-page به جداسازی باند پروتئینی واجد فعالیت زایلانازی با وزن مولکولی 26 کیلودالتون منجر شد از این رو بنظر می رسد تعیین توالی نواحی n ترمینال و c ترمینال پروتئین بتواند به طراحی پرایمرهای مناسب برای جداسازی ژ ن مولد آنزیم زایلاناز منجر شود.

اصطلاح علف هرز به هر گونه گیاهی که ناخواسته بوده و به طور مهاجم رشد کرده و گسترده می شود، اطلاق می¬گردد. از بین روش¬های مرسوم در کنترل علف¬های هرز، به نظر می¬رسد به کارگیری علف¬کش¬های وسیع¬الطیف، به دلیل کمک به حفظ خاک و صرفه جویی اقتصادی بهترین روش می¬باشند و از بین علف¬کش¬ها، آنهایی که با ممانعت از ساخت اسیدآمینه¬ها از تولید پروتئین جلوگیری می¬کنند مناسب¬ترند که از میان آنها می¬توان به گلیفوسیت با نام علمی (ان- فسفونومتیل گلیسین) اشاره کرد اما تاثیر منفی علف¬کش بر روی گیاه هدف، استفاده از آن را مشکل¬ساز نموده است؛ لذا استفاده از روش¬های کلاسیک و مبتنی بر مهندسی ژنتیک برای مقاوم نمودن گیاه به علف-کش ضروری است. گلیفوسیت از طریق ممانعت از عملکرد آنزیم epsps(5- انول پیرویل شیکیمات-3- فسفات سنتاز) در مسیر شیکیمات مانع تولید اسیدآمینه¬های آروماتیک می¬گردد. این آنزیم با ترکیب فسفو انول پیروات(pep) و شیکیمات تری فسفات (s3p) در مسیر شیکیمات، و با انتقال بخش انول پیروویل pep به s3p، تولید 5- انول پیروویل شیکیمات-3- ¬فسفات (epsp) و یک فسفات (pi) می¬نماید و در آخر مسیر، اسیدآمینه¬های آروماتیک تریپتوفان، فنیل¬آلانین و تیروزین ساخته می¬شود. به نظر می¬رسد همپوشانی زیادی بین جایگاه اتصال pep و گلیفوسیت در ساختمان آنزیم وجود دارد و گلیفوسیت برای اتصال به آنزیم با pep و نه باs3p رقابت می¬کند و مانع تولید اسیدآمینه¬های آروماتیک می¬گردد. در تحقیق حاضر با توجه به تحقیقات قبلی مربوط به جداسازی 34 باکتری از خاک¬های باغات مناطق مختلف ایران با سابقه استفاده از این علف¬کش که قادر به رشد در محیط حاوی 3 میلی¬مولار گلیفوسیت بوده و غربال شده¬اند، لذا در این تحقیق پس از غربال¬گری باکتری¬ها در حضور غلظت¬های بالای گلیفوسیت، 4 باکتری از مقاوم¬ترین آنها انتخاب و با انجام روش¬های بیوشیمیایی و مولکولی مانند بررسی 16s rrna، جنس باکتری¬ها شناسایی گردید. به دنبال آن پس از همردیفی ژن¬های epsps از باکتری های گزارش شده¬ مشابه در ncbi، با طراحی آغازگر از مناطق حفاظت شده¬ آنها، ژن epspsباکتری¬های مورد نظر جدا گردید.

چکیده ندارد.