نام پژوهشگر: نسیمه کرم زاده

ایجاد رده سلولی از سلول های بنیادی پالپ دندان انسان القاپذیر با داکسی سایکلین برای ژن های کلون شده در وکتور ptre2hyg
پایان نامه 0 1393
  نسیمه کرم زاده   محمد مهدی یعقوبی

ژن درمانی یک روش درمانی نوین و امیدوار کننده برای درمان و مدیریت مجموعه گوناگونی از بیماری های ژنتیکی و غیر ژنتیکی است. این فناوری برای ارائه یک درمان مطلوب، موثر و طولانی مدت، به پیشرفت در مهندسی وکتورهای ژنی و سیستم های تنظیم ژن برای تسهیل و کنترل بیان ژن نیاز دارد. چرا که بیان همیشگی ژن مورد نظر در بافت نه تنها مفید نیست بلکه بیان نابجا مضر هم هست. سلول های بنیادی پالپ دندان منبع مناسبی از سلول های بنیادی بالغ برای سلول درمانی و ژن درمانی برای ترمیم ضایعات مختلف هستند. یکی از سیستم های قابل تنظیم بیان ژن کلون شده، سیستم tet مبتنی بر اپران مقاومت tn10 tet از باکتری escherichia. coliاست. جزء اولیه سیستم tet، پروتئین تنظیمی مبتنی بر مهار کننده* tetrاست. جزء مهم دیگر آن پلاسمید پاسخ (ptre) است که ژن مورد نظر را تحت کنترل عنصر پاسخ به داکسی سایکلین بیان می کند. این دو جزء در دو پلاسمید جداگانه (ptet-on و ptre2hyg) در دسترس هستند. هدف این پژوهش ایجاد رده سلولی جدید از سلول های بنیادی پالپ دندان انسان القاپذیر با داکسی سایکلین برای ژن های کلون شده در وکتور ptre2hyg با استفاده از سیتسم tet-on بود. پس از جداسازی سلول-های بنیادی پالپ دندان، پلاسمید های ptet-on و ptre2hyg جداگانه و با استفاده از روش های مختلف مانند کلسیم فسفات و استفاده از کیت ترانسفکشن، وارد سلول شدند. برای هر پلاسمید سلول به مدت 2-4 هفته روی محیط آنتی بیوتیک دار مناسب (به ترتیب نئومایسین و هیگرومایسین) کشت داده شد تا کولونی های مقاوم رشد کنند. کولونی هایی که روی هر دو آنتی بیوتیک رشد کرده بودند با داکسی سایکلین القاء شدند. سپس از روش های , pcr rt-pcr و استخراج پروتئین برای اثبات وارد شدن پلاسمید و القای آن استفاده گردید. نتایج حاصل از rt-pcrو pcrنشان دادکه پلاسمید تنظیمی ptet-on به صورت موفقیت آمیز وارد سلول شده است و بیان هم می شود. در مراحل اولیه و با استفاده از کشت حاوی آنتی بیوتیک انتخابی وارد شدن پلاسمید پاسخ حامل ژن مورد نظر به سلول مشخص شد، اما نتایج استخراج پروتئین بیان ژن مورد نظر را تایید ننمود.