چکیده گروه فایتوپلاسمایی aster yellows (candidatus phytoplasma asteris) عامل بیماریهای مهمی در میزبان های مختلف گیاهی مانند سبزیجات، گیاهان زراعی، گلهای زینتی و درختان بوده و خسارت فراوانی را به این محصولات در سراسر جهان وارد می کند. تاکنون زیر گروه های مختلفی برای این گروه فایتوپلاسمایی معرفی شده است که مبنای تفاوت آنها اختلاف در توالی نوکلئوتیدی بعضی از ژنها در این زیر گروه ها می باشد. طی سال های اخیر، ca. phytoplasma asteris به عنوان عامل بیماری فایتوپلاسمایی برخی گیاهان از بعضی استان های ایران مانند استانهای واقع در منطقه مرکزی گزارش شده است. هدف اصلی این پژوهش، تشخیص تفاوت های ژنتیکی جدایه های ca. phytoplasma asteris ردیابی شده در این ناحیه و تعیین زیر گروههای آن در نظر گرفته شد. به این منظور در سال 1387 نمونه های متنوعی از گیاهان مبتلا به بیماریهای فایتوپلاسمایی از استانهای اصفهان، چهارمحال و بختیاری، یزد و مرکزی جمع آوری گردید. علایم مشاهده شده در این گیاهان به صورت زردی، ارغوانی شدن برگ، فیلودی، جاروی جادوگر، تولید ساقه گل دهنده و تغییر شکل در اندام های مختلف گیاه بود. از رگبرگ ها و دمبرگ های این نمونه با استفاده از روش موری و تامسون استخراج dna انجام گرفت. برای ردیابی فایتوپلاسما از واکنش pcr دور اول با جفت آغازگر عمومی فایتوپلاسما p1/p7 استفاده شد و در ادامه کار تکنیک nested-pcr برای تکثیر قسمت داخلی ناحیه s rrna 23-16 با استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r16r2 به کار رفت. با مشاهده قطعات dna تکثیر شده توسط واکنش های pcr روی ژل آگاروز tbe 2/1% الکتروفورز، معلوم گردیدکه فقط تعداد محدودی از نمونه ها در pcr دور اول تکثیر قابل مشاهده در ژل دارند، ولی استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r16r2 در nested-pcr بعد از pcr دور اول با جفت آغازگر p1/p7 ،در اکثر نمونه ها منجر به تولید یک قطعه ~bp 1240 شد. در هیچ کدام از نمونه های سالم در واکنش های pcr و nested-pcr باندی تکثیر نشد. تجزیه و تحلیل برش آنزیمی قطعات dna تکثیر یافته از ناحیه داخلی ژن s rrna23-16 ( جفت آغازگر r16f2n/r16r2 ) با استفاده از آنزیم hhai(cfoi) نشان داد که اکثر نمونه ها مبتلا به گروه فایتوپلاسمایی ca. phytoplasma solani می باشند و برخی دیگر نیز به دو گروه فایتوپلاسمایی ca. phytoplasma trifolii و ca. phytoplasma phoenicium تعلق دارند. در بین نمونه های مزبور، 21 نمونه متعلق به ca. phytoplasma asteris تشخیص داده شدند که این تعداد از میزبان های متفاوت زینتی، زراعی، سبزی و علفهای هرز و از استانهای مختلف جمع آوری شده بودند. در هیچ یک از نمونه های جمع آوری شده از استان چهارمحال و بختیاری این گروه فایتوپلاسمایی ردیابی نشد. برای تعیین زیر گروه های احتمالی ca. phytoplasma asteris، از آنالیز pcr-rflp ناحیه ژن rp تکثیر یافته با جفت آغازگر rp(i)f1a/rp(i)r1a و به کارگیری سه آنزیم alui، msei، tsp509i استفاده گردید. براساس مقایسه الگوی برش آنزیمی نمونه ها، جدایه ها به دو گروه تقسیم شدندکه تعدادی از آن ها به عنوان نماینده هایی از هر گروه تعیین توالی نوکلئوتیدی گردیدند. مقایسه توالی های نوکلئوتیدی این جدایه ها با توالی جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که اکثر جدایه های مورد بررسی در این تحقیق متعلق به زیر گروه (rp-b) هستند و فقط پنج نمونه در زیر گروه rp-l قرار گرفتند که در پیاز، دان سیاه و هویج ردیابی شده بودند . شناسایی هر دوزیرگروه b و l در مناطق مرکزی و از میزبان های مختلف می تواند بیانگر این مطلب باشد که در بین زیر گروه ها محدودیت میزبانی وجود ندارد. با توجه به گزارش فایتوپلاسمای دیگر همراه با ca. phytoplasma asteris از مناطق مرکزی ایران، احتمالاً ناقل مشترکی در گسترش این فایتوپلاسماها نقش دارد. کلمات کلیدی: فایتوپلاسما، pcr-rflp، جدایه، aster yellows

ویروس زردی نکروتیک باقلا faba bean necrotic yellows virus (fbnyv) باعث کاهش عملکرد شدید و فقدان محصول در گیاهان خانواده fabaceae در غرب آسیا و شمال آفریقا می شود. این ویروس از خانواده nanoviridae و دارای ده قطعه مولکول دی ان ای تک لای حلقوی متفاوت است. در ایران آلودگی به این ویروس از مزارع نخود و عدس در استان های قزوین، کرمانشاه، کردستان، آذربایجان شرقی و غربی با استفاده از روش tbia گزارش شده است. هدف اصلی تحقیق حاضر ردیابی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی ویروس fbnyv در استان های غربی و مرکزی ایران می باشد. در سال های 1386و1387 از مزارع حبوبات استان های اصفهان، مرکزی، چهارمحال و بختیاری، کرمانشاه، کردستان و لرستان با علائم زردی، کوتولگی و پیچیدگی ساقه نمونه برداری انجام شد. نمونه های جمع آوری شده از استان های کرمانشاه، کردستان و لرستان در آزمون الیزای غیرمستقیم با استفاده از آنتی سرم چند همسانه ای fbnyv مورد بررسی قرار گرفتند. در این آزمایش از 53 نمونه باقلای استان لرستان هفت نمونه، از 56 نمونه نخود استان کرمانشاه شش نمونه، از 18 نمونه نخود استان کردستان سه نمونه و از 6 نمونه عدس استان کرمانشاه دو نمونه مثبت ارزیابی شدند. از نمونه های جمع آوری شده از استان های اصفهان، مرکزی و چهارمحال و بختیاری و نیز نمونه های مثبت در آزمون الیزا استخراج dna صورت گرفت. جهت تشخیص ویروس از روش nested-pcr استفاده شد. بدین منظور طراحی آغازگرها بر اساس توالی dna-1 جدایه مصری ویروس انجام شد. با استفاده از جفت آغازگرهای دور اول واکنش nested-pcr (dna1f2-dna1r2) باند قابل مشاهده ای تکثیر نشد ولی در دور دوم با استفاده از جفت آغازگرهای dna1f6-dna1r4 باند مورد انتظارbp 387 در تعدادی از نمونه ها مشاهده شد. از 48 نمونه نخود جمع آوری شده از اصفهان 17 نمونه و از 22 نمونه لوبیای این استان چهار نمونه آلوده به ویروس بودند. همچنین از 56 نمونه لوبیای جمع آوری شده از استان مرکزی در 13 نمونه و از 12 نمونه لوبیای استان چهارمحال و بختیاری در هفت نمونه باند مورد نظر تکثیرشد. تعدادی از جدایه ها که نماینده میزبان ها و مناطق جغرافیایی مختلف بودند شامل a5 و a13 (باقلا- استان لرستان)، d13 (نخود-استان کرمانشاه)، m28 (عدس-استان کرمانشاه)، g10 (نخود-استان کردستان)، sa4 ، sn9 و ln4 (نخود-استان اصفهان)، lg3 و lo4 (لوبیا- استان مرکزی) و sh5 (لوبیا-استان چهارمحال و بختیاری) توالی یابی شدند. مقایسه توالی این جدایه ها با ابزار جستجوی blast شباهت بالای آن ها را با توالی جدایه مصری fbnyv-dna1 موجود در genbank نشان داد. نتایج حاصل از همردیف سازی دو تایی نمونه ها با جدایه مصری fbnyv نشان داد که توالی نوکلئوتیدی نمونه های a5، a13k، d13، g10، m28، sa4، sh5 و sn9 به ترتیب دارای 68/98، 55/98، 55/98، 39/97، 10/97، 23/96، 55/98 و 39/97 درصد یکنواختی با جدایه مصری ویروس می باشند. همچنین درصد یکنواختی توالی نوکلئوتیدی این جدایه ها با جدایه سوری ویروس به ترتیب 68/74، 65/75، 65/75، 78/74، 49/74، 43/75، 65/75، 78/74 درصد بود که نشان دهنده شباهت بیشتر جدایه های ایرانی با جدایه مصری این ویروس است. همچنین رسم درخت تبارزایی با 1000 بار تکرار نشان دهنده ارتباط نزدیکتر جدایه های ایرانی با جدایه مصری ویروس بود. ولی هیچگونه همبستگی بر اساس نوع میزبان و موقعیت جغرافیایی بین آن ها مشاهده نشد. همردیف سازی توالی آمینواسیدی جدایه های ایرانی با جدایه های سوری و مصری fbnyv نشان داد که همگی دارای موتیف gxgks [g(ge)gks] می باشند. این تحقیق اولین گزارش از وجود ویروس fbnyv در استان های اصفهان، مرکزی و چهارمحال و بختیاری و نیز اولین گزارش از آلودگی مزارع لوبیا در ایران است

فایتوپلاسماها یک تهدید مهم برای کشت گونه های گیاهی مهم به شمار می روند و باعث ایجاد 700 بیماری در گیاهان مهم اقتصادی مانند درختان میوه، گیاهان علوفه ای، زینتی، سبزی و نیز میزبانان وحشی می گردند. در استان اصفهان نیز بیماریهای فایتوپلاسمایی گسترش قابل توجهی پیدا کرده اند و آلودگی شدیدی به بیماریهای فایتوپلاسمایی در گیاهان علوفه ای وجود دارد. گیاهان مبتلا علایم زردی، ریزبرگی، کوتولگی و جاروی جادوگر نشان می دهند و وقوع خسارت در مزارع منطقه رو به ازدیاد است. به دلیل اینکه در این منطقه بیماریهای فایتوپلاسماهای مختلفی در روی محصولات متفاوت شایع هست و دامنه میزبانی این فایتوپلاسماها به گیاهان لگومینوز نیز گسترش پیدا کرده است، بنابراین در تحقیق حاضر شناسایی و گروه بندی فایتوپلاسماهای آلوده کننده گیاهان علوفه ای در اصفهان مورد توجه قرار گرفت. به این منظور طی سالهای 88- 1387 از گیاهان یونجه، شبدر و اسپرس دارای علایم زردی، ریزبرگی و کم رشدی در مناطق مختلف اصفهان نمونه برداری شد. در اکثر موارد به دلیل پایین بودن غلظت فایتوپلاسما، طی انجام واکنش pcr دور اول هیچ باندی مشاهده نشد، ولی در nested-pcr با استفاده از جفت آغازگر p1/p7 در واکنش pcr اول و r16f2n/r16r2 در واکنش pcr دوم، قطعه مورد انتظار حدود 1239 نوکلئوتیدی ناحیه 16s rdna فایتوپلاسمایی در 57 گیاه آلوده تکثیر شد. ردیابی قطعه dna مورد نظر فایتوپلاسمایی در بوته های یونجه، شبدر و اسپرس دارای علایم فایتوپلاسمایی و عدم تکثیر این قطعه dna در گیاه سالم نشان داد که عوامل فایتوپلاسمایی در ایجاد این بیماری ها در مزارع گیاهان مورد بررسی نقش دارند. به منظور شناسایی جدایه های فایتوپلاسمایی در نمونه های جمع آوری شده از مناطق مختلف از آزمون pcr-rflp استفاده شد. به این منظور قطعه تکثیر شده 1239 نوکلئوتیدی طی واکنش nested-pcr توسط آنزیمهای محدودگر cfoi، msei، kpni، rsai، taqi، alui، haeiii، sau96i برش داده شد. مقایسه الگوی rflp این قطعات با فایتوپلاسماهای شناخته شده مورد استفاده در این تحقیق نشان داد که اکثر این نمونه ها آلوده به فایتوپلاسماهای candidatus phytoplasma solani (گروه 1) و ca. phytoplasma aurantifolia (گروه 2) می باشند. تعداد محدودی از نمونه ها نیز الگوی برشی متفاوتی داشتند که در گروه 3 قرار گرفتند. ترادفهای نوکلئوتیدی قطعه حدود 1239 نوکلئوتیدی ناحیه 16s rdna چهار نمونه از هرگروه نشان داد که در مطابقت با نتایج حاصل از pcr-rflp، جدایه های فایتوپلاسمایی گروه 1 شباهت بسیار زیادی (99%) باتوالی فایتوپلاسماهای ca. phytoplasma solani دارند و جدایه های مربوط به گروه دوم نیز متعلق به گروه ca. phytoplasma aurantifolia می باشند. با تعیین توالی نوکلئوتیدی جدایه های گروه 3 مربوط به آزمون rflpمشخص گردید که تعدادی از این جدایه ها متعلق به گروه aurantifolia ca. phytoplasma هستند، ولی اکثریت آنها به ca. phytoplasma solani شباهت دارند. نکته قابل توجه در بررسی این نمونه ها، مغایرت نتایج توالی یابی با نتایج pcr-rflp در طبقه بندی جدایه های مربوط به گروه 3 بود که معلوم شد جدایه های دو فایتوپلاسمای غالب منطقه علیرغم شباهتهای زیاد، تفاوتهایی نیز از نظر محل برشهای آنزیمی دارند. از این نتایج چنین استنباط شد که pcr-rflp روش دقیقی برای طبقه بندی فایتوپلاسماها نیست و برای تعیین گروه های فایتوپلاسمایی ضروری است که توالی ژنهای حفاظت شده آنها با توالی فایتوپلاسماهای شناخته شده مقایسه گردد. بر اساس نتایج بدست آمده مشخص گردید که فایتوپلاسمای ca. phytoplasma solani شایعترین فایتوپلاسمای مزارع یونجه، شبدر و اسپرس در استان اصفهان است و اهمیت شیوع ca. phytoplasma aurantifolia در مراحل بعدی قرار دارد. در این پژوهش ارتباط معنی داری بین میزان آلودگی فایتوپلاسمایی و میزبان مربوطه و یا ناحیه جغرافیایی بدست نیامد. نتایج حاصل از تعیین فون زنجرک های مزارع مختلف گیاهان علوفه ای مبتلا به بیماریهای فایتوپلاسمایی نشان داد که گونه های متفاوتی از زنجرکهای ناقل فایتوپلاسما در این مزارع حضور دارند. در این تحقیق، رابطه مشخصی بین فراوانی جمعیت زنجرک ها با میزان وقوع آلودگی های فایتوپلاسمایی در مزارع بدست نیامد.

طبق آمار سازمان خوارو بار و کشاورزی سازمان ملل، ایران رتبه هفتم را در بین کشورهای تولیدکننده مرکبات دارد و استان مازندران با سطح زیر کشت بیش از 90 هزار هکتار و تولید بالغ بر 7/1 میلیون تن، اولین استان مرکبات خیز کشور می باشد.. بیماری پسوروز یکی از مهم ترین بیماری های ویروسی مرکبات بوده که در بسیاری از نواحی تولید مرکبات جهان شایع بوده و منجر به بروز خسارت های شدیدی شده است. درختان آلوده به پسوروز a لکه های کلروزه بین رگبرگی را در برگ های جوان فلش های بهاره نشان می دهند. لکه های کلروزه ممکن است قسمتی یا تمام سطح برگ را فرا گیرند. پسوروزb، شکل مهاجم تر بیماری بوده و باعث پوسته فلسی شدن تنه و شاخه های جوان می شود. درختان آلوده، لکه های حلقوی و کلروزه در برگهای مسن را نیز نشان می دهند و زیر برگ ها ترشحات صمغی قهوه ای رنگ ظاهر می شود. عامل بیماری پسوروز مرکبات citrus psorosis virus (cpsv) ، گونه شاخص جنس ophiovirus می باشد. در این تحقیق به منظور شناسایی و تعیین برخی خصوصیات بیولوژیکی و مولکولی ویروس پسوروز مرکبات در استان مازندران، در سال های 1388و 1389 از باغ های مرکبات استان بازدید به عمل آمد. از درختان با علائم بیماری پسوروز شامل پوسته فلسی شدن تنه و شاخه های اصلی، نقش برگ بلوطی و لکه حلقوی روی برگ و نقش حلقوی روی میوه نمونه برداری انجام شد. تعیین آلودگی نمونه های جمع آوری شده با استفاده از آزمون triple antibody sandwich elisa (tas elisa ) توسط آنتی بادی های تک همسانه ای 13c5و a326 و استخراج rna دو رشته ای انجام شد.از میان 30 جدایه مورد بررسی با آزمون الایزا، 16 جدایه آلوده به cpsv و شش نمونه نیز مشکوک به آلودگی با ویروس پسوروز مرکبات تشخیص داده شدند. نقوش الکتروفورزی محصول استخراج شده dsrna از تمامی جدایه های مورد بررسی با استفاده از cf-11، وجود دو باند با اندازه های بزرگتر از bp10000 و حدود bp1700را نشان داد. به نظر می رسد باند حدود 1700 مربوط به آر. ان. ا. دو رشته ای rna2 ویروس باشد. احتمالا باند bp10000 مربوط به فرم دو رشته ای rna1 ویروس می باشد که به صورت دایمر در بالای ژل آگاروز قرار گرفته است. در تعدادی از نمونه ها باند سومی با اندازه bp 1500 مشاهده شد که ظاهرا مربوط به فرم دورشته ای rna3ویروس است. ماهیت دورشته ای بودن آر. ان. ای های استخراج شده با استفاده از هضم آنزیمی توسط dnasei و rnasea در دو مولاریته بالا و پایین ثابت شد.. نوع علائم مشاهده شده در باغ های مرکبات استان مازندران و نرخ پایین مرگ درختان در اثر بیماری پسوروز، نشان دهنده شایع بودن فرمa این ویروس در استان می باشد. این اولین گزارش از تشخیص ویروس پسوروز مرکبات با روش الایزا و بهینه سازی روشی برای استخراج آر. ان. ا. دورشته ای به ترتیب در ایران و جهان می باشد.

اگروکورتیس یکی از بیماریهای مهم مرکبات است که در مناطق مرکبات کاری دنیا مشاهده میشود. علایم این بیماری شامل پوسته پوسته شدن پایه نارنج سه برگی و کوتولگی درختان مرکبات میباشد که در برخی باغهای مازندران دیده شده است. احتمال دیده شده است احتمال ویروئیدی بودن بیماری در سالهای گذشته توسط منتظری و همکاران به وسیله انتقال بیماری با پیوند و به روش مکانیکی به تعدادی از گیاهان محک و مشاهده نوار آر.ان.ای ویروئیدی با الکتروفوز اسید نوکلئیک استخراج شده از گیاهان آلوده در ژل پلی اکریل آمید مشخص شده است. اطلاعات دقیق و کاملی در خصوص وجود گونه ویروئیدی مشخصی در درختان مظنون وجود گونه ویروئیدی مولد بیماری اگزوکورتیس در مازندران نیاز به بررسی مولکولی دارد. از آنجایی که گسترش ویروس تریستزا در مازندران سبب استفاده از پایه های حساس به اگزوکورتیس نظیر سیتریج وسیتروملو گردیده است معرفی روش دقیق و سریع در تشخیص درختان آلوده به ویروئیدهای مولد بیماری اگزوکورنیس در مرکبات مازندان ضروری است.

. اعضاء جنس polerovirus از خانواده luteoviridae که باعث بروز زردی در چغندرقند می شوند شامل سه گونه beet mild yellowing virus (bmyv)، beet chlorosis virus (bchv) و beet western yellows virus (bwyv) هستند. به منظور ردیابی و تعیین برخی خصوصیات ملکولی پلروویروس های آلوده کننده چغندر قند در دو استان اصفهان و چهارمحال وبختیاری در سال های 1385 و 1386 با بازدید تعدادی از مزارع چغندرقند این دو استان، نمونه برداری انجام شد. نمونه های جمع آوری شده ابتدا با آزمون das-elisa و با استفاده از آنتی بادی چندهمسانه ای bwyv مورد بررسی قرار گرفتند. از 216 نمونه جمع آوری شده از مزارع استان چهار محال وبختیاری هیچکدام در آزمون الیزا واکنش مثبت نداشتند. ولی از 290 نمونه های جمع آوری شده در استان اصفهان پنج عدد در آزمون الیزا مثبت ارزیابی شدند. نمونه های الیزا مثبت با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی پلروویروس های آلوده کننده چغندر قند در آزمون rt-pcr مورد بررسی قرار گرفتند. از نمونه های جمع آوری شده از منطقه لورک یک قطعه bp 563 با استفاده از جفت آغازگر cp+/cp- و یک قطعه bp 441 با استفاده از جفت آغازگر mpxbm+/mpxbm- تکثیر شد که نشان دهنده ی آلودگی آن ها به bmyv بود. قطعات تکثیر شده در pcr شامل قطعات bp 563 و bp 441 مربوط به جدایه لورک همسانه سازی و تعیین توالی شدند. مقایسه قطعات توالی-یابی شده با ابزار جستجوی blast شباهت بالای آنها را با توالی پلروویروس های آلوده کننده موجود در بانک ژن آشکار ساخت. همردیف سازی چندتایی قطعات توالی یابی شده، با جدایه های موجود در بانک ژن در سطح آمینواسیدی با نرم افزار dnaman انجام شد. همردیف سازی چند تایی توالی آمینواسیدی ژن پروتیین پوششی جدایه های لورک (bmyv-la) با سایر جدایه ها، بیشترین شباهت این جدایه را با جدایه ی انگلیسی bryv-gb (af167486) به میزان 9/97% نشان داد. میزان تشابه bmyv-la با دیگر جدایه ایرانی موجود در بانک ژن bmyv-iran (af167479) به میزان 4/90% بود. همردیف سازی چندتایی توالی توالی آمینو اسیدی قطعه bp441 از ناحیه ?5 orf0 جدایه لورک با قطعات متناظر خود در جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه لورک بیشترین تشابه را با جدایه bmyv-1 (af168598) از انگلستان به میزان 98% دارد. میزان تشابه جدایه لورک با جدایه bmyv-iran به میزان 2/93% بود. در درخت تبارزایی که براساس توالی آمینواسیدی ژن پروتیین پوششی جدایه ی لورک bmyv-la و جدایه های انتخابی از بانک ژن و به روش neighbor-joining با 1000 بار bootstrap رسم شد، جدایه های چغندرقند لورک همراه با جدایه های آلوده کننده گیاهان خانواده brassicaceae در یک گروه قرار گرفتند. رسم درخت تبارزایی که براساس قسمتی ازتوالی آمینواسیدی ژن orf0 جدایه ی لورک bmyv-la و جدایه های انتخابی از بانک ژن رسم شد، نشان داد جدایه ی چغندر قند لورک همراه با جدایه bmyv-iran با جدایه های bmyv که از نظر بیولوژیکی قادر به آلوده کردن کیسه کشیش می باشند در یک گروه قرار می گیرند. قرار گرفتن جدایه لورک بر اساس توالی آمینواسیدی ژن cp واقع در ´3 ژنوم و ژن orf0 واقع در ´5 ژنوم در دو گروه متفاوت، می تواند نشاندهنده ی وقوع پدیده ی نوترکیبی در این ویروس باشد.

وجود پلاسمید در باکتریهای p.syringae pv.syringae , psedomonas avenae erwinia ananas , agrobacterium tumefaciens , p.solanacearum salmonella sp,esherichia coli xanthomonas campestris pv. hedereبه کمک چند روش جداسازی پلاسمید مورد مطالعه قرار گرفت .استرین های باکتریائی برروی محیط کشت مناسب خود بمدت 24-48 ساعت رشد داده شدند. سلولهای باکتری در بافر te سوسپانسیون گردیده تا جذب نوری آنها در طول موج 600 نانومتر برابر با 5ˆ1 شد. سدیم دو دسیل سولفات (sds) به غلظت نهائی 1 درصد اضافه و لایزت 3بار ازسرنگ شماره 18 عبور داده شد. ph لایزت محتوی قطعات dna کروموزومی با اضافه کردن سود 3 نرمال به 2ˆ12 و بدنبال آن با اضافه کردن تریس 2 مولار، 7 = ph به -9 5ˆ8 رسانده شد. سپس کلرورسدیم 3 درصد و بدنبال آن یک حجم فنی اشباع از کلرورسدیم 3 درصداضافه گردید و به آرامی به هم زده شده و سانتریفوژ گردید. لایزت سانتریفوژ شده و فازروئی جداگردید . کلرور منیزیم و بافر فسفات سدیم 15ˆ0 مولار، 7 = ph و بدنبال آن 7ˆ0 حجم اتانول خنک (سرد) اضافه و لوله ها بمدت 12 ساعت در -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از سانتریفوژ در دور پائین و بدنبال آن حل رسوب حاصل در edta، بمدت 24 ساعت در بافر tes دیالیز شدند. سوسپانسیونهای مرحله نهائی، برروی صفحه افقی ژل 8ˆ0 درصد آگارز در ولتاژ 80 ولت بمدت 8 ساعت الکتروفورز شدند. سپس ژل در اتیدیوم بروماید(4ˆ0 میکروگرم در میلی لیتر) قرار داده شد . باندهای پلاسمیدی در زیر یک دستگاه uv-transilluminator آشکار گردیدند. از بین استرین های باکتریائی مورد مطالعه، erwinia ananas دارای 2 پلاسمید به اندازه 83 و 2ˆ12 مگادالتون و xanthomonas campestris pv.hederaeدارای یک پلاسمید با وزن مولکولی 100 مگادالتون بودند . وزن مولکولی این پلاسمیدها با استفاده از پلاسمیدهائی با وزن مولکولی مشخص از باکتریهای agrobaeterium radiobacter 84 (8ˆ29 و 124 مگادالتون) و pseudomonas glumae ku 8121 (8 و 85 و 124 مگادالتون) تعیین شد. در آزمایش مقاومت به آنتی بیوتیکها xanthomonas campestris pv.hederae و erwinia ananas به پنی سیلین و آمپی سیلین مقاوم بودند. هیچکدام از پلاسمیدها با آکریدین اورنج و اتیدیوم بروماید حذف نشدند.