نام پژوهشگر: افسانه محکمی

مهندسی ژنتیک ریزجلبک chlamydomonas reinhardtii به منظور بررسی پتانسیل تولید amorpha-4,11-diene پیش ساز عامل ضد مالاریایی آرتمیزنین
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه فردوسی مشهد - دانشکده کشاورزی 1393
  افسانه محکمی   حسن مرعشی

مالاریا بیماری خطرناکی است که بیش از یک سوم جمعیت کره زمین را تهدید می کند و امروزه از آرتمیزنین و مشتقات آن به عنوان مهم ترین داروی ضد مالاریا استفاده می شود. آرتمیزنین یک سسکوئی ترپن اندپروکسیدی می باشد که به میزان بسیار اندک در گیاه artemisia annua تولید می شود. برای دستیابی به تولید بیشتر این متابولیت ارزشمند از روش های مهندسی ژنتیک استفاده شده و از آن جا که ریزجلبک ها قابلیت استفاده به عنوان یک سکوی مناسب تولید فرآورده های نوترکیب می باشند، این تحقیق با هدف مهندسی ژنتیک جلبک به منظور بررسی تولید آمورفا دی ان، پیش ساز آرتمیزنین پایه گذاری و انجام شد. این مطالعه در دو آزمایش مورد بررسی قرار گرفت. در مرحله نخست دو ژن کلیدی ads و fpps، از مسیر بیوسنتزی این متابولیت انتخاب و بر اساس ترجیح کدونی کلروپلاست جلبک کلامیدوموناس و سازه کلروپلاستی طراحی شده، سنتز شدند. در آزمایش اول به منظور تراریزش هسته ای، ژن ads داخل ناقل pbi121 همسانه سازی شد. پس از هم کشتی کلامیدوموناس با نژادهای آگروباکتریوم حاوی ناقل pbi121-ads کلون های تراریخت جلبک مشاهده شد. در این آزمایش تعداد کلون های مشاهده شده در محیط گزینشی در هم کشتی با نژاد gv3101 بیش از نژادlba4404 بود. همچنین در این آزمایش بیان پایداری در انتقال با آگروباکتریوم مشاهده نشد و کلون ها بعد از چند روز رشد در محیط گزینشی از بین رفتند. ناپایداری بیان می تواند در نتیجه عدم استفاده از عناصر تنظیمی مناسب جلبک، عدم وجود بهینه سازی کدونی برای هسته و احتمالاً وجود بیان موقت انتقال با آگروباکتریوم باشد. در آزمایش دوم نخست سازه کلروپلاستی طراحی شده سنتز شد. برای این منظور ناحیه 3utr ژن rbcl در انتهای ژن fpps و پیشبر atpa در ابتدای ژن ads قرار گرفت. سپس دو ژن سنتزی و عناصر تنظیمی همراه آنها درکنار یکدیگر قرار گرفته و کاست بیانی موردنظر بدست آمد. در مرحله بعد این کاست بیانی در داخل ناحیه fr(flanking region) ژنوم کلروپلاست کلامیدوموناس قرار گرفت. سپس ناقل کلروپلاستی ایجاد شده از طریق تفنگ ژنی به ریز جلبک کلامیوموناس شلیک شد. تعداد کلون های بدست آمده از طریق شلیک با تفنگ ژنی بسیار کم بود و بین این کلون ها تنها در دو کلون نتایج pcr و rt-pcr آنها مثبت بود. بررسی میزان تولید متابولیت موردنظر در کلون های تراریخت در حال بررسی می باشد.