در این تحقیق از روش کروماتوگرافی مایع با برهمکنش های آب دوستی (hilic) و مشتق سازی پیش از ستونی با روش کروماتوگرافی مایع فاز معکوس (rplc) جهت جداسازی و انداره گیری همزمان ویتامین های محلول در آب استفاده شده است. از روش های طراحی آزمایش جهت بهینه سازی فاکتور های موثر بر فرایند جداسازی همزمان ویتامین های محلول در آب با استفاده از روش hilic استفاده شده است. این روش جداسازی به عنوان ابزاری جهت جداسازی و اندازه گیری ترکیبات با آب دوستی زیاد به کار گرفته شده است. اثر عوامل مختلف بر جداسازی ویتامین های محلول در آب شامل، درصد استونیتریل، ph، غلظت آمونیوم-استات، سرعت جریان و دما با استفاده از روش طراحی مرکب مرکزی مورد بهینه سازی قرار گرفتند. شرایط بهینه برای جداسازی ویتامین های محلول در آب شامل 87% استونیتریل، ph برابر با 3/4، غلظت آمونیوم استات 88/18 میلی مولار، سرعت جریان 78/0 میلی لیتر در دقیقه و دمای 42 درجه سانتیگراد می باشد. در شرایط بهینه منحنی کالیبراسیون هریک از ویتامین-ها با میزان خطی بودن مناسب (999/0<r2) به دست آمد و بر اساس آنها ارقام شایستگی روش شامل محدوده خطی کاری (1500-300، 4000-500، 2/1-2/0، 25-3، 400-50 و 1-?g.ml 120-40 به ترتیب برای ویتامین های 3b، c، 12b، 9b، 5b و 7b و 1-?g.ml 500-50 برای سه ویتامین 1b، 6b و 2b)، حد تشخیص (1-?g.ml 64/90-04/0)، دقت (8/4 >rsd) و صحت (98% <درصد بازیابی) محاسبه شدند. مقادیر حاصل نشانگر کارایی قابل قبول روش در تعیین مقدار ویتامین های محلول در آب در اغلب نمونه های دارویی می-باشد. سرانجام مقدار هفت ویتامین محلول در آب در قرص مولتی ویتامین اندازه گیری شد و نتایج حاصل تطابق خوبی با مقادیر گزارش شده توسط کارخانه سازنده داشت. دو ویتامین بیوتین (7b) و پانتوتنیک اسید (5b) به دلیل جذب ضعیف در محدوده فرابنفش-مرئی (uv-vis) و همچنین مقادیر بالای سایر ویتامین ها با استفاده از روش hilic قابل شناسایی و تعیین مقدار نبودند. جهت اندازه گیری این دو ویتامین از روش مشتق سازی پیش از ستون و rplc استفاده شد. به منظور مشتق سازی از واکنش گروه عاملی کربوکسیلیک اسید دو ویتامین 5b و 7b با فنیل هیدرازین استفاده شد. آمید تشکیل شده از واکنش اسید و آمین در حضور 1- اتیل 3- (3-دی متیل آمینو پروپیل) کربو دی ایمید (edc) و هیدروکسی بنزوتری آزول (hobt) دارای جذب مناسبی در ناحیه uv می باشد. در مرحله بعد بهینه سازی عوامل موثر بر مشتق سازی انجام گرفت و استفاده از نسبت مولی 14 برابر مقدار edc، 5 برابر هیدروکسی بنزو تری آزول hobt، 2 برابر فنیل هیدرازین نسبت به دو ویتامین و زمان 10 دقیقه به عنوان مقادیر بهینه انتخاب شد. در شرایط بهینه فوق، منحنی کالیبراسیون به روش افزایش استاندارد برای هر یک از ویتامین ها رسم شد و سپس حد تشخیص (3/0 و 1-?g.ml 6 به ترتیب برای ویتامین 5b و 7b )، دامنه خطی (30-2 و 1-?g.ml 400-50 به ترتیب برای ویتامین 7b و 5b)، دقت (7/3rsd< ) و صحت (98> درصد بازیابی) محاسبه شد. سرانجام مقادیر ویتامین های بیوتین و پانتوتنیک اسید در قرص مولتی ویتامین اندازه گیری شد و نتایج حاصل تطابق خوبی با مقادیر گزارش شده توسط کارخانه سازنده داشت.