مونوترپنوئیدها ساده ترین دسته ترپنوئیدها می باشند و تنها از 10 اتم کربن (دو واحد ایزوپرن) تشکیل شده اند و عمده ترین اجزا روغن های ضروری گیاهی را تشکیل می دهند. بیش تر اعضای این خانواده از ترکیبات طبیعی، توسط مونوترپن سینتازها یا سیکلازها که تبدیل جرانیل دی فسفات را به والد حلقوی اسکلت مونوترپن های متعدد کاتالیز می کند، ساخته می شوند. جرانیل دی فسفات یک ترکیب غیر حلقوی حدواسط 10 کربنه در بیوسنتز ایزوپرنوئیدها می باشد. در گذشته بیشتر مطالعات به روی تولید یک مسیر هترولوگوس خاص برای تولید مونوترپنوئیدها در escherichia coli متمرکز شده بود اما امروزه میکرواورگانیسم های یوکاریوتی مانند مخمر ساکارومایسس سرویزیه به دلیل مشخصات خاصشان به عنوان یک میزبان میکروبی مناسب برای بیان ژن های فعال یوکاریوتی مورد توجه قرار گرفته اند. ساکارومایسس سرویزیه قادر به تولید و ترشح کارآمد مونوترپن ها نمی باشد که علت عمده آن عدم حضور آنزیم های مونوترپن سینتاز در این میکرواورگانیسم است. در این مطالعه به وسیله ابزار مهندسی متابولیک مسیر بیوسنتز ایزوپرنوئیدها در مخمر ساکارومایسس سرویزیه، با بیان ژن تولیدکننده آنزیم لینالول سینتاز تغییر داده شد. این آنزیم از جرانیل پیروفسفاتی که طی مسیر موالونات در مخمر تولید می شود، به عنوان سوبسترا استفاده کرده و آن را به لینالول تبدیل می کند. لینالول یک مونوترپن غیرحلقوی است که در رایحه گل های بسیاری از گیاهان یافت می شود و علاوه بر مصرف گسترده در صنعت، در درمان سرطان سینه و لوسمی نیز کاربرد دارد. ژن لینالول سینتاز از گیاه اسطوخودوس به وکتورهای بیانی متفاوتی از ساکارومایسس سرویزیه وارد شد. این وکتورهای بیانی تحت کنترل 4 پروموتور ساختاری با قدرت های متفاوت ناشی از ژنهای کدکننده سیتوکروم c اکسیداز (cyc1)، الکل دهیدروژناز(adh)، گلیسر آلدهید 3 فسفات دهیدروژناز(gpd) و فاکتور طویل سازی ترجمه 1 آلفا(tef) ، می باشند. سپس این وکتورهای بیانی به درون مخمر ساکارومایسس سرویزیه انتقال داده شدند و حضور ژن لینالول سینتاز با آنالیز pcr به روی dna ژنومی مخمر تائید شد. میزان بیان ژن فعال لینالول سینتاز در مخمرهای دستورزی شده توسط اندازه گیری انتشار لینالول با استفاده از میکرو استخراج فاز جامد اندازه گیری شد. نتایج به دست آمده میزان بیان لینالول در مخمرها را تا میزان 4 میکروگرم در لیتر تائید کرد. همچنین سیستم های بیانی متشکل از پروموتورهای ذکر شده که با ترمیناتور(خاتمه دهنده) cyc1 همراه بودند با یکدیگر مقایسه شدند و مشخص شد که میزان بیان ژن لینالول سینتاز در وکتورهای بیانی با پروموتور gpd نسبت به بقیه بیشتر است. میزان بیان ژن مذکور تحت تاثیر پروموتور tef بیشتر از adh بود ولی نشانه ای از بیان ژن در وکتورهای تحت کنترل پروموتور cyc1 ارزیابی نگردید.

در تولید فرآورده های زیستی با ارزش افزوده پایین، انتخاب یک سوبسترای ارزان قیمت که دارای بازده بالایی از محصول باشد، می تواند قیمت تمام شده محصول را تا حد زیادی کاهش دهد. در این تحقیق فرآیند تولید صمغ زانتان توسط دو سویه زانتوموناس پلارگونی ptcc1474 و زانتوموناس کمپستریس ptcc1473 با استفاده از سوبستراهای مختلف بررسی شده است. به این منظور با انجام آزمایش های رگرسیون، تاثیر متغیرهای نوع سوبسترا (نشاسته هیدرولیز شده و گلوکز)، نوع سویه (زانتوموناس پلارگونی و زانتوموناس کمپستریس)، غلظت سوبسترا ( g/l 20، 30 و 40) و زمان محصول گیری (24، 48 و 72 ساعت) مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داد نوع سویه، غلظت سوبسترا و زمان محصول گیری عوامل بسیار موثر بر تولید بوده ولی نوع سوبسترا تاثیر چندانی بر میزان تولید زانتان ندارد. همچنین با انجام آزمایش های بهینه سازی برای هر دو سویه، مقدار منابع کربن (نشاسته هیدرولیز شده، نشاسته میوه بلوط)، منبع نیترژن و فسفر با استفاده از روش پاسخ سطح باکس-بنکن بهینه شد. برای منبع کربن آب پنیر نیز منبع فسفر و منیزیم با استفاده از روش پاسخ سطح باکس-بنکن بهینه شد. برای سویه زانتوموناس کمپستریس سطوح بهینه g/l21/53 منبع کربن (نشاسته هیدرولیز شده)، g/l50/8 منبع نیتروژن و g/l10 منبع فسفر، برای تولید g/l 88/9 صمغ زانتان و همچنین برای سویه زانتوموناس پلارگونی سطوح بهینه g/l70 منبع کربن (نشاسته هیدرولیز شده)، g/l17/8 منبع نیتروژن و g/l10 منبع فسفر برای تولید g/l 98/9 صمغ زانتان توسط نرم افزار به دست آمد. در یک فرمانتور 5 لیتری با دور همزن rpm400 و %60 هوادهی، غلظت های g/l40 منبع کربن (نشاسته هیدرولیز شده)، g/l4 منبع نیتروژن و g/l10 منبع فسفر، g/l 3/16 از صمغ زانتان تولید شد. برای سویه زانتوموناس کمپستریس سطوح بهینه g/l100 منبع کربن (نشاسته میوه بلوط)، g/l3 منبع نیتروژن و g/l5 منبع فسفر جهت تولید g/l 93/19 صمغ زانتان و برای سویه زانتوموناس پلارگونی سطوح بهینه g/l100 منبع کربن (نشاسته میوه بلوط)، g/l12 منبع نیتروژن و g/l5 منبع فسفر جهت تولید g/l 07/19 صمغ زانتان بدست آمدند. برای سویه زانتوموناس کمپستریس سه سطح بهینه g/l03/68 منبع کربن (آب پنیر)، g/l09/13 منبع فسفر و g/l25/1منبع منیزیم جهت تولید g/l 67/16 صمغ زانتان و همچنین برای سویه زانتوموناس پلارگونی سه سطح بهینه g/l75/79 منبع کربن (آب پنیر)، g/l33/5 منبع فسفر و g/l62/0 منبع منیزیم جهت تولید g/l 80/12 صمغ زانتان به دست آمد. به منظور استفاده مجدد از سلول ها، ابتدا تثبیت سلولی برای هر دو سویه با استفاده از کلسیم آلژینات بررسی شد. سپس برای بهبود تثبیت سلولی از روش تثبیت تلفیقی از دو ماده کلسیم آلژینات و پلی وینیل الکل استفاده شد. تولید صمغ زانتان توسط سلول های تثبیت شده و با استفاده از دو سوبسترای گلوکز و نشاسته هیدرولیز شده بررسی شد. دانه های به دست آمده از روش تثبیت تلفیقی از استحکام مکانیکی بسیار بالاتری برخوردار بوده و در تعداد چرخه بیشتری قابل استفاده بودند. همچنین سلول های تثبیت شده به روش تلفیقی دارای بازده تولید زانتان بسیار بالاتری نسبت به سلول های تثبیت شده در کلسیم آلژینات بودند.

رشد سریع در صنعتی شدن و افزایش جمعیت در قرن بیست و یکم، موجب تولید حجم بالایی از لجن مازاد توسط کارخانه های تصفیه فاضلاب شده است. مدیریت لجن مازاد یکی از مسائل اساسی کارخانه های تصفیه فاضلاب است. به طوری که در حدود 30 تا 50 درصد از هزینه نهایی تصفیه خانه های فاضلاب صرف از بین بردن لجن مازاد می شود. روش های حذف لجن مازاد نظیر سوزاندن، لندفیل و تخلیه در اقیانوس ها راه کارهای متداولی هستند، که در بلند مدت تأثیرات منفی بر روی محیط زیست خواهند داشت. بنابراین نگرانی رو به رشدی در مورد اثرات زیست محیطی ناشی از دفع این پسماند ایجاد شده است. از طرفی لجن مازاد بالقوه منبعی غنی از ماده و انرژی است که می تواند برای تولید محصولات با ارزش افزوده نظیر سوخت ها، حشره کش ها و پلیمرهای زیستی استفاده شود. در این مطالعه از لجن مازاد حاصل از فرایند لجن فعال تصفیه خانه فاضلاب شهری به عنوان جایگزین مواد مغذی در محیط کشت تولید اتانول استفاده شد. از مخمر ساکارومایسس سرویسیه (cen.pk113-7d)، باکتری زیموموناس موبیلیس (ptcc 1718) و قارچ موکور ایندیکوس (ccug 22424) به عنوان میکروارگانیسم های تولید کننده اتانول استفاده شد. جهت آزاد سازی مواد آلی موجود در لجن مازاد و افزایش بازدهی تولید اتانول از چهار روش پیش فراوری اسیدی، قلیایی، حرارتی و اولتراسونیک بر روی لجن تر و لجن خشک استفاده شد. ابتدا به منظور ارزیابی روش های پیش فراوری، مخمر ساکارومایسس سرویسیه در شرایط هوازی بر روی لجن تر رشد داده شد و میزان رشد به روش cfu اندازه گیری شد. طبق نتایج بدست آمده، بیشترین میزان رشد ساکارومایسس سرویسیه بر روی لجن تر، با پیش فراوری به روش قلیایی حاصل شد. با استفاده از این پیش فراوری غلظت سلول های مخمر در شرایط رشد هوازی بعد از 36 ساعت از (cfu/ml) 105×2/1 به (cfu/ml) 106×5/1 رسید. میزان تولید اتانول در شرایط بی هوازی توسط سه سویه مختلف ساکارومایسس سرویسیه، زیموموناس موبیلیس و موکور ایندیکوس با استفاده از لجن تر و خشک پیش فراوری شده مورد بررسی قرار گرفت. موثرترین روش پیش فراوری برای افزایش تولید اتانول به وسیله سویه های زیموموناس موبیلیس و موکور ایندیکوس روش حرارتی بود، در حالیکه برای ساکارومایسس سرویسیه پیش فراوری لجن به روش قلیایی تأثیر بیشتری نسبت به سه روش دیگر داشت. دو سویه زیموموناس موبیلیس و موکور ایندیکوس از لجن تر پیش فراوری شده به روش حرارتی بترتیب 0/43 و 0/37 گرم اتانول به گرم گلوکز اولیه و از لجن خشک پیش فراوری شده به همین روش به ترتیب 0/45 و 40/ گرم اتانول به ازاء گرم گلوکز اولیه تولید کردند. در حالی که پیش فراوری قلیایی لجن تر و خشک موجب تولید به ترتیب 11/0 و 4/0 گرم اتانول به گرم گلوکز اولیه توسط سویه ساکارومایسس سرویسیه شد. برای بررسی تأثیر مقدار جامدات لجن در محیط تخمیر روی میزان تولید اتانول، مقادیر 0/5، 1 و 3 درصد وزن به حجم (بر اساس وزن خشک) از لجن پیش فراوری شده به روش حرارتی (برای زیموموناس موبیلیس و موکور ایندیکوس) و قلیایی (برای ساکارومایسس سرویسیه) به عنوان منبع مواد مغذی جهت تولید اتانول استفاده شد. طبق نتایج به دست آمده برای هر سه سویه حد غلظتی از لجن که در آن می تواند به عنوان یک عامل محدودکننده در نظر گرفته شود، 10 گرم بر لیتر (1 درصد وزنی) در محیط کشت نهایی تعیین شد. لذا نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد که لجن باقی مانده از تصفیه فاضلاب شهری می تواند به عنوان منبع مواد مغذی تولید اتانول زیستی مورد استفاده قرار گیرد.

ترپنوئید ها دسته ای متنوعی از متابولیت های ثانویه هستند که بیش تر در بافت های گیاهی به عنوان جزء اصلی روغن های ضروری یافت می شوند. به دلیل کاربرد گسترده این ترکیبات در صنایع دارویی، آرایشی و غذایی تولید میکروبی این ترکیبات اخیرا بسیار مورد توجه قرار گرفته است. مخمر ساکارومایسس سرویزیه به دلیل وجود مسیر موالونات به طور طبیعی حاوی پیش ماده ضروری سنتز ترپنوئید ها (ipp ) است و از این رو پتانسیل تولید بسیاری از ترپنوئید ها را دارد. اما به دلیل اختصاص قسمت اعظم ipp موجود در سلول به سنتز ارگوسترول (محصول نهایی مسیر موالونات) و بنابراین کمبود ipp آزاد درون سلولی ، بیان دگر ساخت ترپنوئید ها به سنتز مقدار بسیار کمی از آنها در سلول های مخمر می انجامد. افزایش ipp آزاد درون سلولی عمدتا از طریق افزایش فعالیت آنزیم های کلیدی موجود در مسیر و جلوگیری از مصرف آن در راه تولید ارگوسترول میسر می شود. آنزیم hmg-coa ردوکتاز یکی از آنزیم های کلیدی مسیر موالونات است و بنابراین بالا رفتن میزان آن درسلول می تواند یکی از راهکار های افزایش ipp باشد. از سوی دیگر مهار ژن erg9 (کد کننده آنزیم اسکوالن) از طریق کاهش پیش ساز سنتز ارگوسترول، مانع از تخصیص ippهای موجود در سلول جهت سنتز ارگوسترول می گردد و بدین ترتیب محتوی ipp آزاد درون سلول را بالا می برد. لینالول یک مونوترپنوئید غیر حلقوی معطراست که در بسیاری از گیاهان گلدار و گونه های گیاهی یافت می شود. این مونوترپنوئید علاوه بر کاربرد در صنایع آرایشی و بهداشتی در درمان بیماریهایی مثل لوسمی و سرطان سینه نیز به کار می رود. هدف از این تحقیق تعیین اثر بیش بیان قسمت کاتالیتیک ژن hmg1 ( ژن کد کننده آنزیم hmg-coa ردوکتاز) و مهار ژن erg9 بر روی تولید لینالول و از این طریق دستیابی به سویه ای مخمری باقابلیت تولید بالای لینالول است. در اجرای این تحقیق ابتدا قسمت کاتالیتیک ژن hmg1( thmg1) تحت کنترل پروموتور gal10 در ناقل بیانی pesc-ura همسانه سازی شد. پس از آن با همسانه سازی ژن لینالول سنتاز ( lis) با استفاده از تکنیک gap repair در ناقل مذکور، سازواره pescura-hmg-lis ایجادگردید. به منظور بررسی اثر بیش بیان ژن thmg1 سازواره pescura -lis نیز ساخته شد. انتقال این دو سازواره به دو سویه erg9 و 5d منجر به ایجاد 4 سویه 5d- pesc-lis، 5d- pesc- hmg-lis، erg9- pesc-lis، erg9- pesc - hmg-lis گردید. جهت یافتن زمان مناسب برای نمونه برداری و استخراج لینالول تولید شده در کشت سلولی مورد استفاده، منحنی رشد سویه های موجود رسم شد. پس از استخراج لینالول با استفاده از روش استخراج فاز جامد، میزان سنتز لینالول طی آنالیزکروماتوگرافی گازی ( gc ) محاسبه گردید. بیش بیان ژن thmg1 از طریق بالابردن میزان ipp موجود در سلول و به بیان دیگر رفع محدودیت کمبود ipp در سلول ، باعث بالا دو برابر شدن میزان سنتز لینالول در 5d- pesc- hmg-lis نسبت به سویه 5d- pesc-lis شد. مشاهده میزان لینالول تولیدی توسط دو سویه erg9- pesc-lis و erg9- pesc - hmg-lis نشان می دهد که بیش بیان ژن thmg1 تغییر چندانی درمیزان سنتز لینالول ایجاد نکرد که احتمالا ناشی ازفعال شدن سیستم تنظیم بازخوری سلول و تولید ترکیبات جانبی به دنبال مهار ژن erg9 است . به طور کلی مقایسه غلظت لینالول در سویه های موجود نشان داد که در دو سویه erg9- pesc-lis، erg9- pesc - hmg-lis سنتز لینالول به مراتب بالاتر از دو سویه دیگر است . این مشاهدات بیانگر این است که کاهش تخصیص ipp های درون سلولی جهت سنتز ارگوسترول وتغییر مسیر متابولیسمی به سمت سنتز لینالول تأثیر بیشتری را نسبت به بیش بیان ژن thmg1 روی تولید این ترکیب اعمال کرده است. مهار ژن erg9 به تنهایی موجب سه برابر شدن سنتز لینالول در سلول های مخمر شد.

مخمر ساکارومایسس سرویزیه به عنوان مهمترین مخمر صنعتی و اصلی ترین میکروارگانیسم مولد بیواتانول مطرح است. سویه های صنعتی مخمر طی فرآیند تخمیر، در معرض انواع تنش ها نظیر شوکهای اسمزی، تنش های اکسایشی و سمیت ناشی از متابولیت های ثانویه قرار گرفته که این مسئله منجر به کاهش عملکرد فراورده زیستی مورد نظر می شود. اتانول یک بازدارنده ی رشد در مخمر است که غلظت پایین آن سبب مهار تقسیم سلولی، کاهش حجم سلول و کاهش سرعت رشد شده و غلظت بالای آن سبب کاهش انرژی سلولی و افزایش مرگ سلولی می شود. بنابراین تخمیر موفق زمانی اتفاق می افتد که از سویه های مقاوم مخمر به غلظت های بالایی از اتانول استفاده شود. همچنین تحقیقات نشان داده است که در مخمر در مقادیر کم اکسیدانی، بیان تعداد بیشماری از ژن های دخیل در سم زدایی ros نظیر تیوردوکسین، کاتالاز و گلوتاتیون ردوکتاز افزایش می یابد. این افزایش سنتز آنتی اکسیدان ها، تشکیل دهنده ی اساس واکنش های سازگار بوده که در نهایت منجر به القای مقاومت در مخمر می شود. ولی در دوزهای بالای تنش، سلول های مخمر قادر به مقاومت نبوده و چنین شرایطی منجر به مختل شدن سیستم دفاعی آنها می شود. در این مطالعه به منظور مقاومت مخمر در برابر تنش های اکسایشی، ژن کد کننده متالوتیونین تیپ i برنج، ایزوفرم osmti-1b، که قبلا بیان آن به همراه شریک الحاقیgst در باکتری اشرشیاکلای منجر به مقاومت سلول های تراریخته در برابر پراکسید هیدروژن و کادمیوم شده بود، ابتدا به تنهایی در ناقل بیانی gpd که یک ناقل شاتل است همسانه سازی شد و به سویه ی 5dمخمر ساکارومایسس سرویزیه انتقال یافت. از آنجایی که سویه ی تولید شده مقاومت چندانی به تنش های اکسایشی نشان نداد، بنابراین به منظور افزایش بیان، حلالیت و پایداری osmti-1b در سلول های مخمر، توالی کدکننده ی گلوتاتیون- اس- ترنسفراز (gst) در ابتدای آن قرار داده شد. نهایتا دستواره ی gpd-gst-osmti-1b به سلول های مخمر ساکارومایسس سرویزیه انتقال یافت و سویه 5d-gpd-gst-mt تولید شد. پس از تایید بیان پروتئین gst-osmti-1b به کمک روش وسترن بلات در سویه 5d-gpd-gst-mt ، به منظور سنجش مقاومت ایجاد شده در این سویه، غلظت های مختلف پراکسید هیدروژن، کادمیوم و اتانول به محیط های کشت آن و سویه ی شاهد اعمال شد. نتایج حاصل از مقایسه ی منحنی های رشد در شرایط اعمال تنش بیانگر مقاومت سویه 5d-gpd-gst-mt، نسبت به غلظت های 3 میلی مولار پراکسید هیدروژن، 0.9 میلی مولار کادمیوم و 10% اتانول در مقایسه با سویه ی شاهد بود. همچنین کشت سویه های 5d-gpd-gst-mt و شاهد در محیط حاوی کادمیوم و سپس اندازگیری غلظت کادمیوم موجود در محیط در زمان هایt0 (بلافاصله پس از افزودن کادمیوم به محیط) و t1(پنج ساعت پس از افزودن کادمیوم به محیط) مشخص کرد که افزایش تحمل ایجاد شده در سویه 5d-gpd-gst-mt احتمالا به دلیل تجمع فلز در داخل سلول های مخمر حاوی gst-osmti-1b و نقش این پروتئین در کلاته کردن فلز کادمیوم بوده است.